La investigación fundamental a menudo implica el estudio de poblaciones celulares aisladas. Son estas poblaciones enriquecidas las que permiten a los investigadores hacer nuevos descubrimientos sobre la función celular, la señalización, la expresión génica, las decisiones sobre el destino y mucho más. Las técnicas para el enriquecimiento rápido y preciso de las poblaciones de células diana son un área de gran interés. Las técnicas de clasificación de celdas se dividen en dos categorías generales: clasificación a granel y clasificación de celdas individuales. En la clasificación de celdas a granel, todas las celdas objetivo se recogen en un barrido, mientras que en la clasificación de celdas individuales, cada celda se analiza individualmente. Existen múltiples métodos de clasificación de células a granel: filtración, centrifugación y clasificación de células magnéticas. El principal método de clasificación de una sola célula es la citometría de flujo o la clasificación celular activada por fluorescencia. Mientras que la clasificación de células puede ser muy precisa, es difícil decir que una ordenados de la población de células es «pura». En cambio, la población recogida se conoce como»enriquecida». En general, la clasificación de una sola célula da como resultado poblaciones de células altamente enriquecidas que son más homogéneas que las obtenidas mediante métodos de clasificación a granel.
Centrifugación y filtración
Estas técnicas de clasificación de celdas a granel se basan en características de celdas como el tamaño y la densidad. La filtración requiere una membrana con un tamaño de poro consistente más pequeño que la celda objetivo, pero más grande que los residuos no deseados. Las membranas con una variedad de tamaños de poros están disponibles para seleccionar. La centrifugación se usa comúnmente para la separación inicial de la sangre en plasma, glóbulos blancos y glóbulos rojos. La centrifugación de gradiente de densidad mejora el proceso de separación al agregar un material con una densidad entre la fracción de glóbulos blancos y la fracción de glóbulos rojos; esto permite una separación limpia entre los dos. Las células más pesadas o más densas caen al fondo durante la centrifugación, mientras que el plasma menos denso permanece en la parte superior. Estas técnicas son útiles para la separación aproximada de células; se necesitan técnicas más especializadas para enriquecer tipos celulares específicos basados en marcadores de superficie celular.
Técnicas de clasificación de células magnéticas
La clasificación de células magnéticas es una técnica de enriquecimiento a granel que puede ser altamente específica. La clasificación magnética mediante nanopartículas superparamagnéticas introduce un alto grado de especificidad en un protocolo de enriquecimiento celular. Las nanopartículas superparamagnéticas están hechas de un núcleo de óxido de hierro, típicamente magnetita (Fe3O4), que no es magnético de forma innata, sino que se magnetiza por un campo magnético aplicado. Estas partículas o perlas están recubiertas con sílice o una superficie de polímero para evitar que se aglutinen, y un revestimiento bien elegido también proporciona una superficie rica para la unión covalente de grupos funcionales y anticuerpos. La unión de anticuerpos proporciona especificidad a las partículas superparamagnéticas. Las partículas funcionalizadas se incuban con la solución celular diana, y las células con antígenos de superficie complementarios a los anticuerpos se unirán para formar un conjugado célula-grano. Los conjugados se enriquecen mediante separación de células magnéticas. La clasificación de celdas magnéticas es una buena opción cuando se desea especificidad. Otros métodos de clasificación a granel, como la filtración, la sedimentación y la centrifugación, no pueden lograr tal especificidad. La clasificación magnética es rápida y eficiente. Los sistemas avanzados de separación biomagnética pueden aumentar la precisión de clasificación al proporcionar curvas estándar y monitoreo óptico del proceso de clasificación. Además, los sistemas de separación avanzados están diseñados para proporcionar fuerzas magnéticas suaves y consistentes en todo el volumen de trabajo para aumentar la viabilidad de la célula.
Citometría de flujo clasificación celular basada en fluorescencia
La clasificación celular por citometría de flujo analiza cada célula individualmente. Esta es una técnica extremadamente poderosa que puede proporcionar una gran cantidad de información a la vez. La citometría de flujo es un método de cuantificación ideal para inmunoensayos múltiples. Las células se incuban con anticuerpos marcados con fluoróforos antes de la clasificación. Los anticuerpos son específicos de los antígenos de superficie de las células diana. Cada anticuerpo tiene una longitud de onda de emisión diferente y es identificable de forma única. Un método para etiquetar con precisión los anticuerpos con fluoróforos es el etiquetado en el talón con proteína A.
Después de la incubación con los anticuerpos marcados, la solución celular se envía a través del citómetro de flujo. Esta máquina guía la solución a través de una boquilla del tamaño de un micrón, una célula a la vez. Cada célula se mueve a través de un área de excitación láser, donde el láser excita los flurofores unidos a la superficie celular. Se registra la emisión fluorescente y la célula se dirige a un contenedor de recogida o a un contenedor de desecho de acuerdo con parámetros definidos por el usuario. Se pueden enriquecer varios tipos de células en una sola tirada, y se registra simultáneamente información cuantitativa sobre el número de células y el porcentaje de la población total.
La citometría de flujo es un método altamente informativo, y es la técnica de clasificación celular más precisa, pero también es muy costosa. La máquina en sí a menudo es prohibitivamente cara y requiere un operador capacitado. Muchas instituciones tienen un centro de investigación de citometría de flujo que cobra por hora por el uso de sus máquinas, y estas tasas también pueden ser bastante altas. Por esta razón, muchos laboratorios están volviendo a las técnicas de clasificación magnética. La separación magnética es específica, rápida y eficiente cuando se tiene cuidado de desarrollar y ajustar finamente una estrategia de clasificación.
Costos de clasificadores de celdas
Los clasificadores de celdas pueden costar desde poco menos de $100,000 hasta más de $250,000. La celda más corta más barata se optimizará para un tipo de marcador celular y contendrá solo un láser. El citonoma «Viva» está especializado en células etiquetadas con GFP y se vende por menos de 9 90,000. En el rango entre 1 100,000 y 1 160,000, la máquina tendrá dos láseres y detectará más colores. Bio-rad fabrica una máquina que detecta 4 colores, y el Scindo detects detecta hasta 8 colores. Las máquinas más cercanas a los $250,000 tendrán más láseres y otras características, como el aumento de los formatos de muestra que admite. Sigue siendo una tecnología costosa de usar, aunque la gama de productos sigue creciendo para tratar de ser accesible a más laboratorios. Más laboratorios ahora también consideran la separación magnética. Los separadores magnéticos le costarán entre $1000 y $10000.
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