La recherche fondamentale implique souvent l’étude de populations cellulaires isolées. Ce sont ces populations enrichies qui permettent aux chercheurs de faire de nouvelles découvertes sur la fonction cellulaire, la signalisation, l’expression des gènes, les décisions de destin, et bien plus encore. Les techniques d’enrichissement rapide et précis des populations de cellules cibles sont un domaine d’un grand intérêt. Les techniques de tri de cellules se divisent en deux catégories générales: le tri en vrac et le tri à cellule unique. Dans le tri de cellules en vrac, toutes les cellules cibles sont collectées en un seul balayage, tandis que dans le tri de cellules individuelles, chaque cellule est analysée individuellement. Il existe plusieurs méthodes de tri de cellules en vrac: filtration, centrifugation et tri de cellules magnétiques. La principale méthode de tri cellulaire unique est la cytométrie en flux ou le tri cellulaire activé par fluorescence. Bien que le tri cellulaire puisse être très précis, il est difficile de dire qu’une population cellulaire triée est « pure ». Au lieu de cela, la population recueillie est appelée « enrichie ». En général, le tri de cellules individuelles se traduit par des populations de cellules hautement enrichies qui sont plus homogènes que celles obtenues par des méthodes de tri en vrac.
Centrifugation et filtration
Ces techniques de tri de cellules en vrac reposent sur des caractéristiques de cellules telles que la taille et la densité. La filtration nécessite une membrane avec une taille de pores constante plus petite que la cellule cible, mais plus grande que les débris indésirables. Des membranes avec une variété de tailles de pores sont disponibles au choix. La centrifugation est couramment utilisée pour la séparation initiale du sang en plasma, globules blancs et globules rouges. La centrifugation par gradient de densité améliore le processus de séparation en ajoutant un matériau ayant une densité entre la fraction de globules blancs et la fraction de globules rouges; cela permet une séparation nette entre les deux. Les cellules plus lourdes ou plus denses tombent vers le bas pendant la centrifugation, tandis que le plasma moins dense reste au sommet. Ces techniques sont utiles pour la séparation grossière des cellules; des techniques plus spécialisées sont nécessaires pour enrichir des types cellulaires spécifiques basés sur des marqueurs de surface cellulaire.
Techniques de tri de cellules magnétiques
Le tri de cellules magnétiques est une technique d’enrichissement en masse qui peut être très spécifique. Le tri magnétique à l’aide de nanoparticules superparamagnétiques introduit un degré élevé de spécificité dans un protocole d’enrichissement cellulaire. Les nanoparticules superparamagnétiques sont constituées d’un noyau d’oxyde de fer, généralement de la magnétite (Fe3O4), qui n’est pas naturellement magnétique, mais qui devient magnétisé par un champ magnétique appliqué. Ces particules ou billes sont recouvertes de silice ou d’une surface polymère pour éviter l’agglutination, et un revêtement bien choisi fournit également une surface riche pour la fixation covalente de groupes fonctionnels et d’anticorps. La fixation des anticorps confère aux particules superparamagnétiques une spécificité. Les particules fonctionnalisées sont incubées avec la solution de cellules cibles, et les cellules avec des antigènes de surface complémentaires aux anticorps se lieront pour former un conjugué cellule-perle. Les conjugués sont enrichis par séparation cellulaire magnétique. Le tri des cellules magnétiques est un bon choix lorsque la spécificité est souhaitée. D’autres méthodes de tri en vrac telles que la filtration, la sédimentation et la centrifugation ne peuvent pas atteindre une telle spécificité. Le tri magnétique est rapide et efficace. Les systèmes de séparation biomagnétique avancés peuvent augmenter la précision du tri en fournissant des courbes standard et une surveillance optique du processus de tri. De plus, les systèmes de séparation avancés sont conçus pour fournir des forces magnétiques douces et cohérentes dans tout le volume de travail afin d’augmenter la viabilité des cellules.
Cytométrie en flux tri cellulaire par fluorescence
Le tri cellulaire par cytométrie en flux analyse chaque cellule individuellement. C’est une technique extrêmement puissante qui peut fournir une grande quantité d’informations à la fois. La cytométrie en flux est une méthode de quantification idéale pour les immunoessais multiplex. Les cellules sont incubées avec des anticorps marqués au fluorophore avant le tri. Les anticorps sont spécifiques des antigènes de surface sur les cellules cibles. Chaque anticorps a une longueur d’onde d’émission différente et est identifiable de manière unique. Une méthode de marquage précis des anticorps avec des fluorophores est le marquage sur perle avec la protéine A.
Après incubation avec les anticorps marqués, la solution cellulaire est envoyée à travers le cytomètre en flux. Cette machine guide la solution à travers une buse de la taille d’un micron, une cellule à la fois. Chaque cellule se déplace à travers une zone d’excitation laser, où le laser excite les flurophores liés à la surface de la cellule. L’émission fluorescente est enregistrée et la cellule est dirigée soit dans un récipient de collecte, soit dans un récipient de rejet selon des paramètres définis par l’utilisateur. Plusieurs types de cellules peuvent être enrichis en une seule série, et des informations quantitatives sur le nombre de cellules et le pourcentage de la population totale sont enregistrées simultanément.
La cytométrie en flux est une méthode très informative, et est la technique de tri cellulaire la plus précise, mais elle est également très coûteuse. La machine elle-même est souvent d’un coût prohibitif et nécessite un opérateur formé. De nombreux établissements disposent d’un centre de recherche en cytométrie de flux qui facture à l’heure l’utilisation de leurs machines, et ces taux peuvent également être assez élevés. Pour cette raison, de nombreux laboratoires se tournent vers les techniques de tri magnétique. La séparation magnétique est spécifique, rapide et efficace lorsqu’on prend soin de développer et d’affiner une stratégie de tri.
Coûts du trieur de cellules
Les trieurs de cellules peuvent coûter un peu moins de 100 000 $ à plus de 250 000 $. La cellule la moins chère plus courte sera optimisée pour un type de marqueur de cellule et ne contiendra qu’un seul laser. Le cytonome « Viva » est spécialisé pour les cellules marquées au GFP et se vend à moins de 90 000 $. Entre 100 000 $ et 160 000 $, la machine aura deux lasers et détectera plus de couleurs. Bio-rad fabrique une machine qui détecte 4 couleurs, et le Scindo XT détecte jusqu’à 8 couleurs. Les machines plus proches des 250 000 $ auront plus de lasers et d’autres fonctionnalités telles que l’augmentation des formats d’échantillons pris en charge. C’est encore une technologie coûteuse à utiliser, bien que la gamme de produits continue de s’élargir pour essayer d’être accessible à un plus grand nombre de laboratoires. De plus en plus de laboratoires envisagent également la séparation magnétique. Les séparateurs magnétiques vous coûteront entre 1000 $ et 10000 $.
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