nagyon gyakran a plazmid térképek, különösen a történelmi térképek, amelyeket egy rég elfeledett PhD hallgató kézzel rajzolt, rejtvények. Mik ezek a nyilak és dobozok? Hol kezdjem? Ne aggódj, van egy összeomlási tanfolyamunk a plazmid térképek megfejtéséhez.
ismerkedjen meg az érdeklődésre számot tartó Plazmidjával
kezdjük egy klasszikus plazmiddal: pBR3221. Gyakran használják a derivatív Vektorok gerincét, mert minden olyan tulajdonsággal rendelkezik, amely a sikeres klónozáshoz szükséges (1.ábra). Amint a térképközpontból látható, a linearizált plazmid mérete 4361 bázispár. Mielőtt bármilyen plazmiddal elkezdené dolgozni, tanácsos linearizálni egy egyedi restrikciós enzimmel történő vágással, hogy ellenőrizze, hogy a hirdetett méret nagyjából megegyezik-e a várttal.
1.ábra. A pBR322 vázlata. Kép: Avacop & Yikrazuul via Wikimedia Commons
a fekete nyilak mutatják az átírás irányát, ami elengedhetetlen a klónozáshoz. Ha az érdeklődő gént egy másik gén közepén klónozza, győződjön meg arról, hogy mindkettőt ugyanabba az irányba írják át. Ellenkező esetben a natív promoter zavarhatja a gén expresszióját.
Mit Jelent Az” Ori”?
a génszekvencia-adatbázisokban az ilyen Entrez-PubMed plazmidszekvenciákat lineáris szekvenciákként ábrázolják az ori-tól kezdve. “Ori”: a plazmid replikáció eredete. Bármit is csinálsz, ne változtasd meg! Ha egy plazmid nem képes replikálni, akkor haszontalan.
a másik dolog, amire emlékezni kell az ori-val kapcsolatban, hogy az azonos eredetű plazmidok gyakran inkompatibilisek. Ez azt jelenti, hogy nem lesz képes fenntartani két pbr323 – ból származó vektort egy sejtben, még akkor sem, ha különböző antibiotikum-rezisztencia gének vannak rajtuk. A pbr322 ori-t a pUC18-ban is használják, amely az eukarióta vektorokban használt második leggyakoribb gerinc.
hol találom a korlátozási oldalakat?
a megfelelő enzimek restrikciós helyeit függőleges vonalakként mutatjuk be a kiindulási nukleotidok helyzetével. A webhelyeknek egyedinek kell lenniük, de érdemes ellenőrizni, mivel a származékos Vektorok gyakran tartalmaznak további elfelejtett szekvenciákat.
Mi A Helyzet Az Antibiotikum Rezisztencia Génekkel?
a pBR322-nek két antibiotikum-rezisztencia génje van: tet (tetraciklin rezisztencia) és amp (ampicillin rezisztencia). Ezek a gének egy efflux pumpát (tetR) és béta-laktamázt (ampR) kódolnak, hogy a tetraciklint és az ampicillint kiválasszák a sejtből. A Tet és az amp különböző irányokban olvasható.
ne feledje, hogy a béta-laktamáz enzim nem specifikus a penicillinből származó antibiotikumok méregtelenítésében. Tehát még akkor is, ha két különböző replikációs eredetű plazmidja van, nem lesz képes egyszerre két plazmidot kiválasztani, ha az egyik meticillin-rezisztencia gént, a másik pedig ampicillin-rezisztencia gént fejez ki.
amikor restrikciós enzimhelyeket használ az érdeklődésre számot tartó gén plazmidba történő klónozására, ügyeljen arra, hogy megnézze, mely helyek tartoznak az antibiotikum-rezisztencia génjébe. Például a PvuI az AmpR közepén, a BamHI pedig a TetR közepén vág. És, Mint mindannyian tudjuk, a zavar egy gén vezet inaktiválása gén funkció – ebben az esetben, antibiotikum-rezisztencia.
hogyan kezdődik és áll le a replikáció?
a gének mellett a plazmidok gyakran tartalmaznak E. coli fágokból származó transzkripciós promotereket és Terminátorokat. Az SP6 és T7 fágokból származó promotereket gyakran használják in vitro RNS amplifikációhoz. Fágpolimerázokat igényelnek, ezért in vivo inaktívak.
az alábbiakban a pTLNX , a Xenopus oocita expressziós vektor térképe látható (2.ábra). Az ismert pBR322 eredetű és antibiotikum rezisztencia gének mellett AmpR és CmR (kloramfenikol rezisztencia), vannak SP6 és lacUV promoterek is. Az SP6 promótertől lefelé az rrnBT2 Terminátor lehetővé teszi a többszörös klónozásba klónozott gének hatékony megszüntetését2 (2.ábra).
a pTLNX vektornak van egy génje a plazmidszelekcióhoz (ccdB), valamint a vírus SV40 nukleáris lokalizációs szignálja és a Xenopus globine 3′ UTR, amely lehetővé teszi a klónozott gének magas expressziós szintjét.
Ismerje meg forrásait
a házi készítésű térképek gyakran megbízhatatlanok, mivel kihagyják a kísérlet szempontjából kritikus “lényegtelen” funkciókat. Ha vektoros térképre van szüksége, akkor jobb, ha olyan ismert térképtárakat használ, mint az Addgene, az Entrez-PubMed, valamint az érdeklődésre számot tartó vektort értékesítő vállalatok webhelyei.
2.ábra. A pTLNX vázlata. Kép: Addgene.
a plazmid térképek mindig fejlődnek, ezért valószínű, hogy hozzájárulásait a jövőbeli kollégái számára hagyják. Kérjük, adja meg a lehető legtöbb részletet a térképen! Boldog térkép olvasás és rajz.
Források:
- Balb (1986), Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). “A pbr322 plazmidvektor és speciális célú származékai-áttekintés”. Gene. 50 (1-3): 3–40. doi:1016/0378-1119 (86)90307-0.
- Geertsma ER, Dutzler R. (2011). Sokoldalú és hatékony, nagy áteresztőképességű klónozó eszköz a strukturális biológia számára. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z
ez segített neked? Akkor kérjük, ossza meg a hálózattal.