az alapkutatás gyakran magában foglalja az izolált sejtpopulációk tanulmányozását. Ezek a gazdagított populációk teszik lehetővé a kutatók számára, hogy új felfedezéseket tegyenek a sejtek működéséről, a jelátvitelről, a génexpresszióról, a sors döntéseiről és még sok másról. A célsejtpopulációk gyors és pontos dúsítására szolgáló technikák nagy érdeklődésre számot tartó terület. A cellarendezési technikák két általános kategóriába sorolhatók: tömeges rendezés és egycellás rendezés. A tömeges cellarendezés során az összes célsejtet egy sweepben gyűjtik össze, míg az egysejtes válogatásban minden cellát külön-külön elemeznek. Az ömlesztett sejtek válogatásának többféle módja van: szűrés, centrifugálás és mágneses cellák válogatása. A fő egysejtes válogatási módszer az áramlási citometria vagy a fluoreszcenciával aktivált sejtválogatás. Bár a sejtek rendezése nagyon pontos lehet, nehéz azt mondani, hogy a rendezett sejtpopuláció “tiszta”. Ehelyett az összegyűjtött populációt “gazdagítottnak”nevezik. Általánosságban elmondható, hogy az egysejtes válogatás erősen dúsított sejtpopulációkat eredményez, amelyek homogénebbek, mint az ömlesztett válogatási módszerekkel nyert sejtek.
centrifugálás és szűrés
ezek az ömlesztett sejtválogatási technikák a sejtek jellemzőire, például méretére és sűrűségére támaszkodnak. A szűréshez olyan membránra van szükség, amelynek állandó pórusmérete kisebb, mint a célsejt, de nagyobb, mint a nem kívánt törmelék. A különböző pórusméretekkel rendelkező membránok közül választhat. A centrifugálást általában a vér plazmába, fehérvérsejtekbe és vörösvértestekbe történő kezdeti elválasztására használják. A sűrűséggradiens centrifugálás javítja az elválasztási folyamatot azáltal, hogy olyan anyagot ad hozzá, amelynek sűrűsége a fehérvérsejt-frakció és a vörösvérsejt-frakció között van; ez lehetővé teszi a kettő tiszta elválasztását. A nehezebb vagy sűrűbb sejtek a centrifugálás során az aljára esnek, míg a kevésbé sűrű plazma a tetején marad. Ezek a technikák hasznosak a sejtek durva elválasztásához; speciálisabb technikákra van szükség a sejtfelszíni markerek alapján meghatározott sejttípusok dúsításához.
mágneses cellás válogatási technikák
a mágneses cellás válogatás olyan ömlesztett dúsítási technika, amely nagyon specifikus lehet. A szuperparamágneses nanorészecskékkel végzett mágneses válogatás nagyfokú specifitást vezet be a sejtdúsítási protokollba. A szuperparamágneses nanorészecskék vas-oxid magjából készülnek, jellemzően magnetit (Fe3O4), amely nem veleszületett mágneses, de egy alkalmazott mágneses mező mágnesezi. Ezeket a részecskéket vagy gyöngyöket szilícium-dioxiddal vagy polimer felülettel vonják be, hogy megakadályozzák az összetapadást, és egy jól megválasztott bevonat gazdag felületet biztosít a funkcionális csoportok és antitestek kovalens kötődéséhez. Az antitestek kötődése biztosítja a szuperparamágneses részecskék specifitását. A funkcionalizált részecskéket a célsejtoldattal inkubáljuk, és az antitestekkel komplementer felületi antigénekkel rendelkező sejtek kötődnek, hogy sejt-gyöngy konjugátumot képezzenek. A konjugátumokat mágneses sejtszétválasztással gazdagítják. A mágneses cellák válogatása jó választás, ha specifikusságra van szükség. Más ömlesztett válogatási módszerek, mint a szűrés, ülepítés, centrifugálás nem érhetnek el ilyen specifitást. A mágneses válogatás gyors és hatékony. A fejlett biomágneses elválasztó rendszerek növelhetik a rendezési pontosságot a standard görbék és a rendezési folyamat optikai monitorozásával. Ezenkívül a fejlett elválasztó rendszereket úgy tervezték, hogy gyengéd és következetes mágneses erőket biztosítsanak a teljes munkamennyiségben, hogy növeljék a sejtek életképességét.
áramlási citometria fluoreszcencia alapú sejtválogatás
sejtválogatás áramlási citometriával elemzi az egyes sejteket külön-külön. Ez egy rendkívül hatékony technika, amely egyszerre nagy mennyiségű információt képes szolgáltatni. Az áramlási citometria ideális kvantifikációs módszer a multiplex immunvizsgálatokhoz. A sejteket fluoroforral jelölt antitestekkel inkubáljuk a rendezés előtt. Az antitestek specifikusak a célsejtek felszíni antigénjeire. Minden antitest emissziós hullámhossza eltérő, és egyedileg azonosítható. Az antitestek fluorofórokkal történő pontos címkézésének egyik módszere a gyöngyön történő címkézés a fehérjével.
a jelölt antitestekkel történő inkubálás után a sejtoldatot az áramlási citométeren keresztül küldjük. Ez a gép egy mikron méretű fúvókán keresztül vezeti az oldatot egy cellánként. Minden sejt egy lézer gerjesztési területen mozog, ahol a lézer gerjeszti a sejtfelszínhez kötött fluroforokat. A fluoreszcens emissziót rögzítik, és a cellát vagy egy gyűjtőtartályba, vagy egy eldobótartályba irányítják a felhasználó által meghatározott paraméterek szerint. Több sejttípus dúsítható egyetlen futás alatt, és a sejtszámra és a teljes populáció százalékára vonatkozó mennyiségi információkat egyszerre rögzítik.
az áramlási citometria rendkívül informatív módszer, a legpontosabb sejtválogatási technika, de nagyon drága is. Maga a gép gyakran megfizethetetlenül drága, és képzett kezelőt igényel. Sok intézmény rendelkezik egy áramlási citometriai kutatási központtal, amely óránkénti díjat számít fel gépeik használatáért, és ezek az arányok is meglehetősen magasak lehetnek. Emiatt sok laboratórium fordul vissza a mágneses válogatási technikák felé. A mágneses elválasztás specifikus, gyors és hatékony, ha ügyelünk a válogatási stratégia kidolgozására és finomhangolására.
Cell sorter költségek
Cell rendezők költsége alig 100 000 dollár felett 250 000 dollár. A legolcsóbb cella rövidebb lesz optimalizálva egy típusú sejt marker és csak egy lézer. A cytonome “Viva” szakosodott GFP jelölt sejtek és eladja kevesebb, mint $90,000. A 100 000 és 160 000 dollár közötti tartományban a gép két lézerrel rendelkezik, és több színt fog észlelni. A Bio-rad olyan gépet készít, amely 4 színt érzékel, a Scindo XT pedig akár 8 színt is érzékel. A 250 000 dollárhoz közelebb eső gépek több lézerrel és egyéb funkciókkal rendelkeznek, mint például a támogatott mintaformátumok növekedése. Ez még mindig drága technológia, bár a termékskála továbbra is növekszik, hogy több laboratórium számára hozzáférhetővé váljon. Több laboratórium is fontolóra veszi a mágneses elválasztást. A mágneses elválasztók 1000-10000 dollárba kerülnek.
kapcsolódó hírek
- Multiplex immunvizsgálatok
- genomi DNS izolálás
- a megfelelő DNS-extrakciós protokoll kiválasztása