非常に多くの場合、プラスミドマップ、特に長い間忘れられていた博士課程の学生によって手描きされた歴史的なものは、パズルです。 これらの矢印とボックスは何ですか？ どこから始めるのですか？ 心配しないで、我々はプラスミドマップを解読するためのクラッシュコースの紹介を持っています。
興味のあるプラスミドに慣れる
古典的なプラスミドpbr3221から始めましょう。 これは、クローニングを成功させるために必要なすべての機能を備えているため、派生ベクトルのバックボーンとしてよく使用されます(図1)。 マップ中央からわかるように、線形化されたプラスミドのサイズは4361塩基対です。 プラスミドの作業を開始する前に、独自の制限酵素で切断して線形化し、広告されたサイズが予想とほぼ同じであることを確認することをお勧めし
図1。 PBR322の回路図。 Avacopによる画像&Yikrazuul Via Wikimedia Commons
黒い矢印は、クローニングに不可欠な転写の方向を示しています。 別の遺伝子の途中で目的の遺伝子をクローン化する場合は、両方が同じ方向に転写されていることを確認してください。 それ以外の場合は、ネイティブプロモーターは、あなたの遺伝子発現を妨害することができます。
“オリ”とはどういう意味ですか？
Entrez-PubMedなどの遺伝子配列データベースでは、プラスミド配列はoriから始まる直鎖配列として図示されている。 「Ｏｒｉ」は、プラスミド複製の起点を意味する。 あなたが何をしても、それを変更しないでください！ プラスミドが複製することができないと、それは役に立たない。
oriについて覚えておくべきもう一つのことは、同じ起源を持つプラスミドはしばしば互換性がないということです。 これは、異なる抗生物質耐性の遺伝子を持っていても、1つの細胞に2つのpbr323由来のベクターを維持することができないことを意味します。 Pbr322oriは、真核生物ベクターで使用される第二の最も一般的な骨格であるpuc18でも使用されています。
制限サイトはどこで見つけることができますか？対応する酵素のための
制限部位は出発ヌクレオチドの位置の縦線として示されています。 サイトは一意でなければなりませんが、派生ベクトルには追加の忘れられた配列が含まれることが多いため、確認する必要があります。
抗生物質耐性遺伝子はどうですか？
pbr322は、tet（テトラサイクリン耐性）とamp（アンピシリン耐性）の二つの抗生物質耐性遺伝子を持っています。 これらの遺伝子は、それぞれ、細胞からテトラサイクリンとアンピシリンを排泄するために流出ポンプ（tetR）とβ-ラクタマーゼ（ampR）をコードしています。 Tetとampは異なる方向に読み取られます。
ベータラクタマーゼ酵素はペニシリン由来の抗生物質の解毒に特異的ではないことに注意してください。 したがって、複製の起源が異なる二つのプラスミドを持っていても、一方がメチシリン耐性遺伝子を発現し、他方がアンピシリン耐性遺伝子を発現
制限酵素部位を使用して目的の遺伝子をプラスミドにクローン化する場合は、抗生物質耐性遺伝子内にある部位を調べるように注意してください。 例えば、ＰｖｕｉはＡｍｐｒの中央で切断し、ＢａｍｈｉはＴｅｔｒの中央で切断する。 そして、我々はすべて知っているように、遺伝子の破壊は、遺伝子機能の不活性化につながる–この場合には、抗生物質耐性。
レプリケーションはどのように開始および停止しますか？
プラスミドには、遺伝子に加えて、大腸菌ファージに由来する転写プロモーターおよびターミネーターが含まれることが多い。 ファージSP6およびT7からのプロモーターは、多くの場合、in vitro RNA増幅のために使用されます。 それらはファージポリメラーゼを必要とし、従ってin vivoで不活性である。
以下は、アフリカツメガエル卵母細胞発現ベクターであるpTLNXのマップです（図2）。 よく知られているpbr322起源および抗生物質耐性遺伝子AmpRおよびCmR（クロラムフェニコール耐性）に加えて、SP6およびlacUVプロモーターも存在する。 SP6プロモーターの下流では、rrnbt2ターミネーターは、マルチクローニングサイト2にクローン化された遺伝子の効率的な終了を可能にします（図2）。
pTLNXベクターには、プラスミド選択遺伝子（ccdB）、ウイルスSV40核局在シグナル、アフリカツメガエルglobine3’UTRがあり、クローニングされた遺伝子の高発現レベルを可能にする。
あなたのソースを知っている
自家製の地図は、実験にとって重要な”重要でない”機能を省略しているため、信頼できないことがよくあります。 ベクトルマップが必要な場合は、Addgene、Entrez-PubMed、関心のあるベクトルを販売する企業のサイトなどの既知のマップリポジトリを使用することをお勧めします。
図2. PTLNXの回路図。 Addgeneからの画像。
プラスミドマップは常に進化しているので、あなたの貢献はあなたの将来の同僚のために残される可能性があります。 あなたの地図にできるだけ多くの詳細を含めてください！ 幸せな地図の読み取りと描画。
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- Geertsma ER,Dutzler R.(2011). 構造生物学のための多目的で、有効な高効率のクローニングツール。 50(15):3272-8. ドイ:10.1021/bi200178z
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