Nybegynnerens Guide Til Å Lese Plasmid Kart

svært ofte plasmid kart, spesielt historiske de som er håndtegnet av en lang glemt PhD student, er et puslespill. Hva er disse pilene og boksene? Hvor skal jeg begynne? Ikke bekymre deg, vi har et lynkurs innføring i tyde plasmid kart.

Gjør Deg kjent Med Ditt Plasmid Av Interesse

la oss starte med et klassisk plasmid: pBR3221. Det er ofte brukt som en ryggrad for avledede vektorer fordi den har alle funksjonene som trengs for en vellykket kloning (Figur 1). Som du ser fra kartsenteret, er størrelsen på det lineariserte plasmidet 4361 basepar. Før du begynner å jobbe med et plasmid, anbefales det å linearisere det ved å kutte med et unikt begrensningsenzym for å kontrollere at den annonserte størrelsen er omtrent den samme som forventet.

Figur 1. Skjematisk av pBR322. Bilde av Avacop & Yikrazuul via Wikimedia Commons

de svarte pilene viser transkripsjonsretningen, noe som er viktig for kloning. Hvis du klone genet av interesse i en midten av et annet gen, sørg for at begge er transkribert i samme retning. Ellers kan den innfødte promotoren forstyrre genuttrykket ditt.

Hva Betyr» Ori»?

i gensekvensdatabaser er Slike Entrez-PubMed, plasmid-sekvenser diagrammert som lineære sekvenser som starter fra oriene. «Ori» betyr opprinnelsen til plasmidreplikasjon. Uansett hva du gjør, ikke endre det! Når et plasmid ikke klarer å replikere, er det ubrukelig.

den andre tingen å huske om ori er at plasmider med samme opprinnelse ofte er inkompatible. Dette betyr at du ikke vil kunne opprettholde to pbr323-avledede vektorer i en celle, selv om de har gener for forskjellige antibiotikaresistanser på dem. PBR322 ori brukes også i pUC18, som er den nest vanligste ryggraden som brukes i eukaryote vektorer.

Hvor Finner Jeg Restriksjonssidene?

Restriksjonssteder for tilsvarende enzymer vises som vertikale linjer med posisjonen til startnukleotidene. Nettstedene skal være unike, men det lønner seg å sjekke, da avledede vektorer ofte inneholder flere glemte sekvenser.

Hva Med Antibiotikaresistensgener?

pBR322 har to antibiotikaresistensgener: tet (tetracyklinresistens) og amp (ampicillinresistens). Disse genene koder for en efflukspumpe (tetR) og beta-laktamase (ampR) for å skille ut henholdsvis tetracyklin og ampicillin fra cellen. Tet og amp leses i forskjellige retninger.

Husk at enzymet beta-laktamase ikke er spesifikt ved avgiftning av penicillin-avledede antibiotika. Så selv om du har to plasmider med forskjellig opprinnelse av replikering, vil du ikke kunne velge to plasmider samtidig hvis man uttrykker et meticillinresistensgen og det andre uttrykker et ampicillinresistensgen.

når du bruker restriksjonsenzymsider for å klone genet av interesse i plasmidet ditt, må du være forsiktig med å se på hvilke nettsteder som faller innenfor antibiotikaresistensgenet ditt. For eksempel kutter PvuI i Midten Av AmpR, Og BamHI kutter i Midten Av TetR. Og som vi alle vet, vil forstyrrelsen i et gen føre til inaktivering av genfunksjonen – i dette tilfellet antibiotikaresistens.

Hvordan Starter Og Stopper Replikering?

i tillegg til gener inkluderer plasmider ofte transkripsjonspromotorer og terminatorer avledet Fra E. coli-fag. Promotorer FRA fag SP6 Og T7 brukes ofte til in vitro rna-forsterkning. De krever fagpolymeraser og er derfor inaktive in vivo.

Nedenfor Er et kart over pTLNX, En Xenopus oocytt uttrykksvektor (Figur 2). I tillegg til de kjente pBR322-opprinnelses-og antibiotikaresistensgenene AmpR og CmR (kloramfenikolresistens), er DET OGSÅ SP6-og lacUV-promotorer tilstede. Nedstrøms FRA sp6 promoter, den rrnBT2 terminator tillater effektiv avslutning av gener klonet i multiple kloning site2 (Figur 2).

pTLNX-vektoren har også et gen for plasmid-seleksjon (ccdB), sammen med virus SV40 nukleært lokaliseringssignal og Xenopus globin 3′ UTR, som muliggjør høye uttrykksnivåer av klonede gener.

Kjenn Dine Kilder

Hjemmelagde kart er ofte upålitelige da De utelater» uviktige » funksjoner som kan være kritiske for eksperimentet ditt. Hvis du trenger et vektorkart, er det bedre å bruke kjente kartlagre som Addgene, Entrez-PubMed og nettsteder av selskaper som selger din vektor av interesse.

Figur 2. Skjematisk av pTLNX. Bilde Fra Addgene.

Plasmid kart er alltid i utvikling,så det er sannsynlig at dine bidrag vil bli igjen for dine fremtidige kolleger. Ta med så mange detaljer som mulig i kartet! Glad kartlesing og tegning.

Kilder:

1. Balbá P, Soberó X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). «Plasmid vector pBR322 og dets spesielle formål derivater-en gjennomgang». Gene. 50 (1-3): 3–40. doi:1016/0378-1119 (86)90307-0.
2. Geertsma ER, Dutzler R. (2011). En allsidig og effektiv høy gjennomstrømning kloning verktøy for strukturbiologi. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z