badania podstawowe często obejmują badanie izolowanych populacji komórek. To właśnie te wzbogacone populacje umożliwiają naukowcom dokonywanie nowych odkryć na temat funkcji komórek, sygnalizacji, ekspresji genów, decyzji o losie i wielu innych. Techniki szybkiego i dokładnego wzbogacania populacji komórek docelowych są obszarem dużego zainteresowania. Techniki sortowania komórek dzielą się na dwie ogólne kategorie: sortowanie zbiorcze i sortowanie pojedynczych komórek. W sortowaniu zbiorczym wszystkie komórki docelowe są zbierane w jednym cyklu, podczas gdy w sortowaniu pojedynczych komórek każda komórka jest indywidualnie analizowana. Istnieje wiele metod sortowania komórek masowych: filtracja, odwirowanie i sortowanie komórek magnetycznych. Główną metodą sortowania pojedynczych komórek jest cytometria przepływowa lub sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją. Chociaż sortowanie komórek może być bardzo dokładne, trudno powiedzieć, że posortowana populacja komórek jest „czysta”. Zamiast tego zebrana populacja jest określana jako „wzbogacona”. Ogólnie rzecz biorąc, sortowanie pojedynczych komórek powoduje wysoce wzbogacone populacje komórek, które są bardziej jednorodne niż te uzyskane metodami sortowania masowego.
odwirowanie i filtracja
te techniki sortowania komórek masowych opierają się na cechach komórek, takich jak rozmiar i gęstość. Filtracja wymaga membrany o stałej wielkości porów mniejszej niż komórka docelowa, ale większej niż niepożądane zanieczyszczenia. Membrany o różnych rozmiarach porów są dostępne do wyboru. Odwirowanie jest powszechnie stosowane do wstępnego oddzielania krwi do osocza, białych krwinek i czerwonych krwinek. Odwirowanie gradientu gęstości poprawia proces separacji poprzez dodanie materiału o gęstości między frakcją białych krwinek a frakcją czerwonych krwinek; pozwala to na czystą separację między tymi dwoma. Cięższe lub bardziej gęste komórki opadają na dno podczas wirowania, podczas gdy mniej gęsta Plazma pozostaje na górze. Techniki te są przydatne do szorstkiej separacji komórek; bardziej wyspecjalizowane techniki są potrzebne do wzbogacania określonych typów komórek w oparciu o markery powierzchni komórek.
techniki sortowania komórek magnetycznych
sortowanie komórek magnetycznych jest techniką masowego wzbogacania, która może być wysoce specyficzna. Sortowanie magnetyczne przy użyciu nanocząstek superparamagnetycznych wprowadza wysoki stopień swoistości do protokołu wzbogacania komórek. Nanocząstki superparamagnetyczne są wykonane z rdzenia tlenku żelaza, zwykle magnetytu (Fe3O4), który nie jest z natury magnetyczny, ale staje się namagnesowany przez przyłożone pole magnetyczne. Te cząstki lub kulki są pokryte krzemionką lub powierzchnią polimerową, aby zapobiec zbrylaniu się, a dobrze dobrana powłoka zapewnia również bogatą powierzchnię do kowalencyjnego przyłączania grup funkcyjnych i przeciwciał. Przyłączenie przeciwciał zapewnia cząstkom superparamagnetycznym swoistość. Funkcjonalizowane cząstki inkubuje się z roztworem komórki docelowej, a komórki z antygenami powierzchniowymi komplementarnymi do przeciwciał wiążą się tworząc koniugat komórka-koralik. Koniugaty są wzbogacane przez separację komórek magnetycznych. Sortowanie komórek magnetycznych jest dobrym wyborem, gdy wymagana jest specyficzność. Inne metody sortowania luzem, takie jak filtracja, sedymentacja i odwirowanie, nie mogą osiągnąć takiej specyficzności. Sortowanie magnetyczne jest szybkie i wydajne. Zaawansowane systemy separacji biomagnetycznej mogą zwiększyć dokładność sortowania, zapewniając standardowe krzywe i optyczne monitorowanie procesu sortowania. Dodatkowo, zaawansowane systemy separacji są zaprojektowane tak, aby zapewnić delikatne i spójne siły magnetyczne w całej objętości roboczej, aby zwiększyć żywotność komórek.
cytometria przepływowa sortowanie komórek oparte na fluorescencji
sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej analizuje każdą komórkę indywidualnie. Jest to niezwykle potężna technika, która może dostarczyć dużą ilość informacji na raz. Cytometria przepływowa jest idealną metodą kwantyfikacji dla multipleksowych testów immunologicznych. Komórki są inkubowane z przeciwciałami znakowanymi fluoroforem przed sortowaniem. Przeciwciała są specyficzne dla antygenów powierzchniowych na komórkach docelowych. Każde przeciwciało ma inną długość fali emisji i jest jednoznacznie identyfikowalne. Jedną z metod precyzyjnego znakowania przeciwciał fluoroforami jest znakowanie na koraliku białkiem A.
po inkubacji z znakowanymi przeciwciałami roztwór komórkowy jest przesyłany przez cytometr przepływowy. Maszyna ta prowadzi roztwór przez dyszę wielkości mikronów po jednej komórce na raz. Każda komórka porusza się przez obszar wzbudzenia laserowego, gdzie laser pobudza flurofory związane z powierzchnią komórki. Emisja fluorescencji jest rejestrowana, a ogniwo jest kierowane do pojemnika zbiorczego lub pojemnika odrzucanego zgodnie z parametrami zdefiniowanymi przez użytkownika. Wiele typów komórek można wzbogacić w jednym cyklu, a informacje ilościowe o liczbie komórek i procent całkowitej populacji są jednocześnie rejestrowane.
cytometria przepływowa jest bardzo pouczającą metodą i jest najbardziej precyzyjną techniką sortowania komórek, ale jest również bardzo droga. Sama maszyna jest często zbyt droga i wymaga przeszkolonego operatora. Wiele instytucji posiada centrum badawcze cytometrii przepływowej, które pobiera opłaty za godzinę za korzystanie z ich maszyn, a stawki te mogą być również dość wysokie. Z tego powodu wiele laboratoriów powraca w kierunku technik sortowania magnetycznego. Separacja magnetyczna jest specyficzna, szybka i wydajna, gdy starannie opracowujemy i precyzyjnie dostrajamy strategię sortowania.
koszty sortowania komórek
sortowniki komórek mogą kosztować od nieco poniżej $100,000 do ponad $250,000. Najtańsza komórka krótsza zostanie zoptymalizowana dla jednego typu markera komórkowego i zawiera tylko jeden laser. Cytonom „Viva”specjalizuje się w komórkach znakowanych GFP i sprzedaje za mniej niż $90,000. W przedziale od 100 000 do 160 000 dolarów maszyna będzie miała dwa lasery i wykryje więcej kolorów. Bio-rad tworzy maszynę, która wykrywa 4 kolory, a Scindo XT wykrywa do 8 kolorów. Maszyny bliżej $250,000 będą miały więcej laserów i inne funkcje, takie jak wzrost formatów próbek, które obsługuje. Nadal jest to droga technologia w użyciu, choć gama produktów nadal rośnie, aby starać się być dostępne dla większej liczby laboratoriów. Więcej laboratoriów rozważa teraz również separację magnetyczną. Separatory magnetyczne będą kosztować w zakresie $1000 do $10000.
powiązane wiadomości
- Multiplex immunoassays
- izolacja genomowego DNA
- wybór odpowiedniego protokołu ekstrakcji DNA