a pesquisa Fundamental geralmente envolve o estudo de populações de células isoladas. São essas populações enriquecidas que permitem aos pesquisadores fazer novas descobertas sobre a função celular, sinalização, expressão gênica, decisões de destino e muito mais. As técnicas para o enriquecimento rápido e preciso das populações de células-alvo são uma área de grande interesse. As técnicas de classificação de células se enquadram em duas categorias gerais: classificação em massa e classificação de célula única. Na classificação de células a granel, todas as células-alvo são coletadas em uma varredura, enquanto na classificação de células únicas, cada célula é analisada individualmente. Existem vários métodos de classificação de células a granel: filtração, centrifugação e classificação de células magnéticas. O principal método de classificação de célula única é a citometria de fluxo ou a triagem de células ativadas por fluorescência. Embora a classificação de células possa ser muito precisa, é difícil dizer que uma população de células classificadas é “pura”. Em vez disso, a população coletada é referida como “enriquecida”. Em geral, a classificação de células únicas resulta em populações de células altamente enriquecidas que são mais homogêneas do que as obtidas por meio de métodos de classificação em massa.
centrifugação e filtração
essas técnicas de classificação de células a granel dependem de características celulares, como tamanho e densidade. A filtração requer uma membrana com um tamanho de poro consistente menor que a célula alvo, mas maior que os detritos indesejados. Membranas com uma variedade de tamanhos de poros estão disponíveis para selecionar. A centrifugação é comumente usada para a separação inicial do sangue em plasma, glóbulos brancos e glóbulos vermelhos. A centrifugação de gradiente de densidade melhora o processo de separação adicionando um material com uma densidade entre a fração de glóbulos brancos e a fração de glóbulos vermelhos; isso permite uma separação limpa entre os dois. As células mais pesadas ou mais densas caem para o fundo durante a centrifugação, enquanto o plasma menos denso permanece no topo. Essas técnicas são úteis para a separação aproximada das células; técnicas mais especializadas são necessárias para enriquecer tipos de células específicas com base em Marcadores de superfície celular.
técnicas de classificação de células magnéticas
a classificação de células magnéticas é uma técnica de enriquecimento a granel que pode ser altamente específica. A classificação magnética usando nanopartículas superparamagnéticas introduz um alto grau de especificidade a um protocolo de enriquecimento celular. Nanopartículas superparamagnéticas são feitas de um núcleo de óxido de ferro, tipicamente magnetita (Fe3O4), que não é inatamente magnético, mas torna-se magnetizado por um campo magnético aplicado. Essas partículas ou grânulos são revestidos com sílica ou uma superfície de polímero para evitar aglomeração, e um revestimento bem escolhido também fornece uma superfície rica para a fixação covalente de grupos funcionais e anticorpos. A ligação de anticorpos fornece as partículas superparamagnéticas com especificidade. As partículas funcionalizadas são incubadas com a solução de célula-alvo, e as células com antígenos de superfície complementares aos anticorpos se ligam para formar um conjugado de esferas celulares. Os conjugados são enriquecidos pela separação de células magnéticas. A classificação de células magnéticas é uma boa escolha quando a especificidade é desejada. Outros métodos de classificação a granel, como filtração, sedimentação e centrifugação, não podem atingir essa especificidade. A classificação magnética é rápida e eficiente. Sistemas avançados de separação biomagnética podem aumentar a precisão de classificação, fornecendo curvas padrão e monitoramento óptico do processo de classificação. Além disso, sistemas avançados de separação são projetados para fornecer forças magnéticas suaves e consistentes em todo o volume de trabalho para aumentar a viabilidade celular.
Citometria de Fluxo de fluorescência de base de classificação de células
classificação de Células por citometria de fluxo, analisa cada célula individualmente. Esta é uma técnica extremamente poderosa que pode fornecer uma grande quantidade de informações ao mesmo tempo. A citometria de fluxo é um método de quantificação ideal para imunoensaios multiplex. As células são incubadas com anticorpos marcados com fluoróforo antes do tipo. Os anticorpos são específicos para antígenos de superfície nas células-alvo. Cada anticorpo tem um comprimento de onda diferente da emissão e é excepcionalmente identificável. Um método de rotulagem precisa de anticorpos com fluoróforos é a rotulagem on-bead com proteína A.
após a incubação com os anticorpos rotulados, a solução celular é enviada através do citômetro de fluxo. Esta máquina guia a solução através de um bocal mícron-feito sob medida uma pilha de cada vez. Cada célula se move através de uma área de excitação a laser, onde o laser excita os fluróforos ligados à superfície da célula. A emissão fluorescente é registrada e a célula é direcionada para um recipiente de coleta ou para um recipiente de descarte de acordo com parâmetros definidos pelo Usuário. Vários tipos de células podem ser enriquecidos em uma única corrida, e informações quantitativas sobre números de células e porcentagem da população total são registradas simultaneamente.
a citometria de fluxo é um método altamente informativo e é a técnica de classificação celular mais precisa, mas também é muito cara. A máquina em si é muitas vezes proibitivamente cara e requer um operador treinado. Muitas instituições têm uma instalação de núcleo de pesquisa de citometria de fluxo que cobra por hora pelo uso de suas máquinas, e essas taxas também podem ser bastante altas. Por esta razão, muitos laboratórios estão voltando para técnicas de classificação magnética. A separação magnética é específica, rápida e eficiente quando é tomado cuidado para desenvolver e ajustar finamente uma estratégia de classificação.
classificador de células custos
classificadores de células podem custar de pouco menos de $100.000 a mais de $250.000. A célula mais barata mais Curta será otimizada para um tipo de marcador de célula e conterá apenas um laser. O cytonome “Viva” é especializado para pilhas etiquetadas GFP e vende por menos de $90.000. Na faixa entre US $100.000 e US $160.000, a máquina terá dois lasers e detectará mais cores. Bio-rad faz uma máquina que detecta 4 cores, e o Scindo XT detecta até 8 cores. Máquinas mais próximas dos US $250.000 terão mais lasers e outros recursos, como aumento nos formatos de amostra que ele suporta. Ainda é uma tecnologia cara de usar, embora a gama de produtos continue a crescer para tentar ser acessível a mais laboratórios. Mais laboratórios agora também consideram a separação magnética. Separadores magnéticos vai custar – lhe na faixa de US $1000 a US $10000.
notícias
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