foarte des hărțile plasmidice, în special cele istorice care sunt desenate manual de un doctorand uitat de mult, sunt un puzzle. Care sunt aceste săgeți și cutii? De unde să încep? Nu vă faceți griji, avem un curs intensiv de introducere în descifrarea hărților plasmidelor.
familiarizarea cu plasmida dvs. de interes
să începem cu o plasmidă clasică: pBR3221. Este adesea folosit ca coloană vertebrală pentru vectori derivați, deoarece are toate caracteristicile necesare pentru o clonare reușită (Figura 1). După cum vedeți din centrul hărții, dimensiunea plasmidei liniarizate este de 4361 perechi de baze. Înainte de a începe să lucrați cu orice plasmidă, este recomandabil să o liniarizați prin tăierea cu o enzimă de restricție unică pentru a verifica dacă dimensiunea anunțată este aproximativ aceeași cu cea așteptată.
Figura 1. Schema pBR322. Imagine de Avacop & Yikrazuul via Wikimedia Commons
săgețile negre arată direcția transcrierii, care este esențială pentru clonare. Dacă vă clonați gena de interes într-un mijloc al altei gene, asigurați-vă că ambele sunt transcrise în aceeași direcție. În caz contrar, promotorul nativ poate interfera cu expresia genelor.
Ce Înseamnă „Ori”?
în bazele de date ale secvențelor genetice, astfel de secvențe plasmidice Entrez-PubMed sunt diagramate ca secvențe liniare pornind de la ori. „Ori” înseamnă originea replicării plasmidelor. Orice ai face, nu-l schimba! Odată ce o plasmidă nu este capabilă să se reproducă, este inutilă.
celălalt lucru de reținut despre ori este că plasmidele cu aceeași origine sunt adesea incompatibile. Aceasta înseamnă că nu veți putea menține doi vectori derivați din pBR323 într – o singură celulă, chiar dacă au gene pentru diferite rezistențe la antibiotice. Pbr322 ori este, de asemenea, utilizat în pUC18, care este a doua coloană vertebrală cea mai comună utilizată în vectorii eucarioți.
unde pot găsi site-urile de restricție?
locurile de restricție pentru enzimele corespunzătoare sunt prezentate ca linii verticale cu poziția nucleotidelor de pornire. Site-urile ar trebui să fie unice, dar merită verificat, deoarece vectorii derivați conțin adesea secvențe uitate suplimentare.
Ce Zici De Genele De Rezistență La Antibiotice?
pBR322 are două gene de rezistență la antibiotice: tet (rezistența la tetraciclină) și amp (rezistența la ampicilină). Aceste gene codifică o pompă de eflux (tetR) și beta-lactamază (amp) pentru a excreta tetraciclină și, respectiv, ampicilină din celulă. Tet și amp sunt citite în direcții diferite.
rețineți că enzima beta-lactamază nu este specifică în detoxifierea antibioticelor derivate din penicilină. Deci, chiar dacă aveți două plasmide cu origini diferite de replicare, nu veți putea selecta două plasmide în același timp dacă una exprimă o genă de rezistență la meticilină, iar cealaltă exprimă o genă de rezistență la ampicilină.
când utilizați site-uri de enzime de restricție pentru a clona gena de interes în plasmida dvs., aveți grijă să vă uitați la site-urile care se încadrează în gena dvs. de rezistență la antibiotice. De exemplu, PvuI taie în mijlocul amp și bamhi taie în mijlocul TetR. Și, după cum știm cu toții, întreruperea unei gene va duce la inactivarea funcției genice – în acest caz, rezistența la antibiotice.
cum începe și se oprește replicarea?
pe lângă gene, plasmidele includ adesea promotori de transcripție și Terminatori derivați din fagii E. coli. Promotorii din fagii SP6 și T7 sunt adesea utilizați pentru amplificarea ARN in vitro. Acestea necesită polimeraze de fagi și, prin urmare, sunt inactive in vivo.
mai jos este o hartă a ptlnx , un vector de expresie a ovocitelor Xenopus (Figura 2). Pe lângă originea familiară pBR322 și genele de rezistență la antibiotice AmpR și CmR (rezistența la cloramfenicol), există și promotori SP6 și lacUV. În aval de promotorul SP6, terminatorul rrnbt2 permite terminarea eficientă a genelor clonate în site-ul de clonare multiplă2 (Figura 2).
vectorul pTLNX are, de asemenea, o genă pentru selecția plasmidelor (ccdB), împreună cu virusul SV40 semnal de localizare nucleară și Xenopus globine 3′ UTR, care permite niveluri ridicate de Expresie ale genelor clonate.
cunoaște-ți sursele
hărțile de casă sunt adesea nesigure, deoarece omit caracteristici „neimportante” care pot fi esențiale pentru experimentul tău. Dacă aveți nevoie de o hartă vectorială, este mai bine să utilizați depozite de hărți cunoscute, cum ar fi Addgene, Entrez-PubMed și site-uri ale companiilor care vă vând vectorul de interes.
Figura 2. Schema pTLNX. Imagine din Addgene.
hărțile plasmidelor evoluează întotdeauna, deci este probabil ca contribuțiile dvs. să fie lăsate pentru viitorii dvs. colegi. Vă rugăm să includeți cât mai multe detalii posibil în harta ta! Fericit harta lectură și desen.
Surse:
- Balb X, Sober X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). „Vectorul plasmidic pBR322 și derivatele sale cu scop special-o revizuire”. Gene. 50 (1-3): 3–40. doi: 1016/0378-1119 (86)90307-0.
- Geertsma ER, Dutzler R. (2011). Un instrument versatil și eficient de clonare cu randament ridicat pentru biologia structurală. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z
te-a ajutat asta? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.