cercetarea fundamentală implică adesea studiul populațiilor de celule izolate. Aceste populații îmbogățite permit cercetătorilor să facă noi descoperiri despre funcția celulară, semnalizarea, expresia genelor, deciziile de soartă și multe altele. Tehnicile pentru îmbogățirea rapidă și precisă a populațiilor de celule țintă sunt o zonă de mare interes. Tehnicile de sortare a celulelor se încadrează în două categorii generale: sortarea în vrac și sortarea cu o singură celulă. În sortarea celulelor în vrac, toate celulele țintă sunt colectate într-o singură măturare, în timp ce în sortarea unei singure celule fiecare celulă este analizată individual. Există mai multe metode de sortare a celulelor în vrac: filtrare, centrifugare și sortare a celulelor magnetice. Principala metodă de sortare cu o singură celulă este citometria în flux sau sortarea celulelor activate prin fluorescență. În timp ce sortarea celulelor poate fi foarte precisă, este greu de spus că o populație de celule sortate este „pură”. În schimb, populația colectată este denumită”îmbogățită”. În general, sortarea cu o singură celulă are ca rezultat populații de celule foarte îmbogățite, care sunt mai omogene decât cele obținute prin metode de sortare în vrac.
centrifugarea și filtrarea
aceste tehnici de sortare a celulelor în vrac se bazează pe caracteristicile celulare precum dimensiunea și densitatea. Filtrarea necesită o membrană cu o dimensiune consistentă a porilor mai mică decât celula țintă, dar mai mare decât resturile nedorite. Membranele cu o varietate de dimensiuni ale porilor sunt disponibile pentru a selecta. Centrifugarea este frecvent utilizată pentru separarea inițială a sângelui în plasmă, globule albe și globule roșii. Centrifugarea cu gradient de densitate îmbunătățește procesul de separare prin adăugarea unui material cu o densitate între fracția de celule albe din sânge și fracția de celule roșii din sânge; acest lucru permite o separare curată între cele două. Celulele mai grele sau mai dense cad în partea de jos în timpul centrifugării, în timp ce plasma mai puțin densă rămâne în partea de sus. Aceste tehnici sunt utile pentru separarea brută a celulelor; sunt necesare tehnici mai specializate pentru îmbogățirea tipurilor de celule specifice pe baza markerilor suprafeței celulare.
tehnici de sortare a celulelor magnetice
sortarea celulelor magnetice este o tehnică de îmbogățire în vrac care poate fi foarte specifică. Sortarea magnetică folosind nanoparticule superparamagnetice introduce un grad ridicat de specificitate unui protocol de îmbogățire a celulelor. Nanoparticulele superparamagnetice sunt formate dintr-un miez de oxid de fier, de obicei magnetit (Fe3O4), care nu este magnetic înnăscut, ci devine magnetizat de un câmp magnetic aplicat. Aceste particule sau margele sunt acoperite cu silice sau o suprafață polimerică pentru a preveni aglomerarea, iar o acoperire bine aleasă oferă, de asemenea, o suprafață bogată pentru atașarea covalentă a grupurilor funcționale și a anticorpilor. Atașarea anticorpilor asigură specificitatea particulelor superparamagnetice. Particulele funcționalizate sunt incubate cu soluția de celule țintă, iar celulele cu antigene de suprafață complementare anticorpilor se vor lega pentru a forma un conjugat celulă-șirag de mărgele. Conjugatele sunt îmbogățite prin separarea celulelor magnetice. Sortarea celulelor magnetice este o alegere bună atunci când se dorește specificitatea. Alte metode de sortare în vrac, cum ar fi filtrarea, sedimentarea și centrifugarea, nu pot atinge o astfel de specificitate. Sortarea magnetică este rapidă și eficientă. Sistemele avansate de separare biomagnetică pot crește precizia sortării prin furnizarea de curbe standard și monitorizarea optică a procesului de sortare. În plus, sistemele avansate de separare sunt proiectate pentru a oferi forțe magnetice blânde și consistente pe tot volumul de lucru pentru a crește viabilitatea celulelor.
citometrie în flux sortare celulară pe bază de fluorescență
Sortare celulară prin citometrie în flux analizează fiecare celulă individual. Aceasta este o tehnică extrem de puternică care poate oferi o cantitate mare de informații simultan. Citometria în flux este o metodă ideală de cuantificare pentru imunotestele multiplex. Celulele sunt incubate cu anticorpi marcați cu fluorofor înainte de sortare. Anticorpii sunt specifici antigenelor de suprafață de pe celulele țintă. Fiecare anticorp are o lungime de undă de emisie diferită și este identificabil în mod unic. O metodă de etichetare precisă a anticorpilor cu fluorofori este etichetarea pe margele cu proteina A.
după incubarea cu anticorpii marcați, soluția celulară este trimisă prin citometrul de flux. Această mașină ghidează soluția printr-o duză de dimensiuni micronice, o celulă la un moment dat. Fiecare celulă se deplasează printr-o zonă de excitație laser, unde laserul excită fluroforii legați de suprafața celulei. Emisia fluorescentă este înregistrată, iar celula este direcționată fie într-un recipient de colectare, fie într-un recipient aruncat în funcție de parametrii definiți de utilizator. Mai multe tipuri de celule pot fi îmbogățite într-o singură rulare, iar informațiile cantitative despre numărul de celule și procentul din populația totală sunt înregistrate simultan.
citometria în flux este o metodă extrem de informativă și este cea mai precisă tehnică de sortare a celulelor, dar este, de asemenea, foarte scumpă. Mașina în sine este adesea prohibitiv de costisitoare și necesită un operator instruit. Multe instituții au o instalație de bază de cercetare a citometriei în flux care se încarcă cu ora pentru utilizarea mașinilor lor, iar aceste rate pot fi, de asemenea, destul de mari. Din acest motiv, multe laboratoare se întorc spre tehnicile de sortare magnetică. Separarea magnetică este specifică, rapidă și eficientă atunci când se are grijă să se dezvolte și să se regleze fin o strategie de sortare.
costurile de sortare a celulelor
sortatoarele de celule pot costa de la puțin sub 100.000 USD la peste 250.000 USD. Cea mai ieftină celulă mai scurtă va fi optimizată pentru un tip de marker celular și va conține un singur laser. Citonomul „Viva” este specializat pentru celulele etichetate cu GFP și se vinde cu mai puțin de 90.000 de dolari. În intervalul cuprins între 100.000 și 160.000 de dolari, mașina va avea două lasere și va detecta mai multe culori. Bio-rad face o mașină care detectează 4 culori, iar Scindo XT detectează până la 8 culori. Mașinile mai apropiate de cei 250.000 de dolari vor avea mai multe lasere și alte caracteristici, cum ar fi creșterea formatelor de eșantion pe care le acceptă. Este încă o tehnologie costisitoare de utilizat, deși gama de produse continuă să crească pentru a încerca să fie accesibilă mai multor laboratoare. Mai multe laboratoare iau în considerare și separarea magnetică. Separatoarele magnetice vă vor costa între 1000 și 10000 USD.
știri conexe
- imunoteste Multiplex
- izolarea ADN-ului Genomic
- alegerea protocolului de extracție a ADN-ului adecvat