La ricerca fondamentale spesso comporta lo studio di popolazioni cellulari isolate. Sono queste popolazioni arricchite che consentono ai ricercatori di fare nuove scoperte sulla funzione cellulare, la segnalazione, l’espressione genica, le decisioni sul destino e molto altro. Le tecniche per l’arricchimento rapido e accurato delle popolazioni di cellule bersaglio sono un’area di grande interesse. Le tecniche di ordinamento delle celle si dividono in due categorie generali: ordinamento bulk e ordinamento single cell. Nell’ordinamento delle celle alla rinfusa tutte le celle bersaglio vengono raccolte in un’unica scansione, mentre nell’ordinamento delle celle singole ogni cella viene analizzata individualmente. Esistono diversi metodi di smistamento delle celle alla rinfusa: filtrazione, centrifugazione e smistamento delle celle magnetiche. Il principale metodo di ordinamento a cellule singole è la citometria a flusso o l’ordinamento delle cellule attivate a fluorescenza. Mentre l’ordinamento delle celle può essere molto accurato, è difficile dire che una popolazione di celle ordinata sia “pura”. Invece, la popolazione raccolta viene definita “arricchita”. In generale, lo smistamento a cellule singole produce popolazioni cellulari altamente arricchite che sono più omogenee di quelle ottenute tramite metodi di smistamento alla rinfusa.
Centrifugazione e filtrazione
Queste tecniche di smistamento delle celle di massa si basano su caratteristiche delle celle come dimensioni e densità. La filtrazione richiede una membrana con una dimensione coerente del poro più piccola della cellula dell’obiettivo, ma più grande dei detriti indesiderati. Membrane con una varietà di dimensioni dei pori sono disponibili tra cui scegliere. La centrifugazione è comunemente usata per la separazione iniziale di sangue nel plasma, nei globuli bianchi e nei globuli rossi. La centrifugazione a gradiente di densità migliora il processo di separazione aggiungendo un materiale con una densità tra la frazione di globuli bianchi e la frazione di globuli rossi; ciò consente una separazione pulita tra i due. Le cellule più pesanti o più dense cadono sul fondo durante la centrifugazione, mentre il plasma meno denso rimane nella parte superiore. Queste tecniche sono utili per la separazione approssimativa delle cellule; sono necessarie tecniche più specializzate per arricchire specifici tipi di cellule basati su marcatori di superficie cellulare.
Tecniche di smistamento a celle magnetiche
Lo smistamento a celle magnetiche è una tecnica di arricchimento di massa che può essere altamente specifica. L’ordinamento magnetico che utilizza nanoparticelle superparamagnetiche introduce un alto grado di specificità in un protocollo di arricchimento cellulare. Le nanoparticelle superparamagnetiche sono costituite da un nucleo di ossido di ferro, tipicamente magnetite (Fe3O4), che non è innatamente magnetico, ma diventa magnetizzato da un campo magnetico applicato. Queste particelle o perline sono rivestite con silice o una superficie polimerica per evitare l’aggregazione, e un rivestimento ben scelto fornisce anche una superficie ricca per l’attaccamento covalente di gruppi funzionali e anticorpi. L’attaccamento degli anticorpi fornisce specificità alle particelle superparamagnetiche. Le particelle funzionalizzate vengono incubate con la soluzione cellulare bersaglio e le cellule con antigeni di superficie complementari agli anticorpi si legheranno per formare un coniugato cella-tallone. I coniugati sono arricchiti dalla separazione delle cellule magnetiche. L’ordinamento delle cellule magnetiche è una buona scelta quando la specificità è desiderata. Altri metodi di smistamento alla rinfusa come filtrazione, sedimentazione e centrifugazione non possono raggiungere tale specificità. L’ordinamento magnetico è rapido ed efficiente. I sistemi avanzati di separazione biomagnetica possono aumentare la precisione di ordinamento fornendo curve standard e monitoraggio ottico del processo di selezione. Inoltre, i sistemi di separazione avanzati sono progettati per fornire forze magnetiche delicate e coerenti in tutto il volume di lavoro per aumentare la vitalità cellulare.
Citometria a flusso ordinamento delle cellule basato sulla fluorescenza
Ordinamento delle cellule per citometria a flusso analizza ogni cellula individualmente. Questa è una tecnica estremamente potente che può fornire una grande quantità di informazioni contemporaneamente. La citometria a flusso è un metodo di quantificazione ideale per i test immunologici multiplex. Le cellule sono incubate con anticorpi marcati con fluoroforo prima del tipo. Gli anticorpi sono specifici per gli antigeni di superficie sulle cellule bersaglio. Ogni anticorpo ha una diversa lunghezza d’onda di emissione ed è identificabile in modo univoco. Un metodo per etichettare con precisione gli anticorpi con fluorofori è l’etichettatura on-bead con proteina A.
Dopo l’incubazione con gli anticorpi marcati, la soluzione cellulare viene inviata attraverso il citometro a flusso. Questa macchina guida la soluzione attraverso un ugello di dimensioni micron una cella alla volta. Ogni cellula si muove attraverso un’area di eccitazione laser, dove il laser eccita i flurofori legati alla superficie cellulare. L’emissione fluorescente viene registrata e la cella viene diretta in un contenitore di raccolta o in un contenitore di scarto in base a parametri definiti dall’utente. Più tipi di celle possono essere arricchiti in una singola esecuzione e vengono registrate simultaneamente informazioni quantitative sui numeri di celle e sulla percentuale della popolazione totale.
La citometria a flusso è un metodo altamente informativo ed è la tecnica di smistamento cellulare più precisa, ma è anche molto costosa. La macchina stessa è spesso proibitivamente costosa e richiede un operatore addestrato. Molte istituzioni hanno un centro di ricerca di citometria a flusso che carica di ora in ora per l’uso delle loro macchine, e questi tassi possono anche essere piuttosto alti. Per questo motivo molti laboratori stanno tornando indietro verso tecniche di smistamento magnetico. La separazione magnetica è specifica, rapida ed efficiente quando si cura di sviluppare e ottimizzare finemente una strategia di smistamento.
Cell sorter costs
Cell smistatori possono costare da appena sotto $100.000 a oltre $250.000. La cella più economica più corta sarà ottimizzata per un tipo di marcatore cellulare e contiene solo un laser. Il citonome “Viva” è specializzato per le cellule etichettate GFP e vende per meno di $90.000. Nell’intervallo tra $100.000 e $160.000 la macchina avrà due laser e rileverà più colori. Bio-rad fa una macchina che rileva 4 colori, e il Scindo XT rileva fino a 8 colori. Le macchine più vicine ai formats 250.000 avranno più laser e altre caratteristiche come l’aumento dei formati di esempio che supporta. È ancora una tecnologia costosa da usare, anche se la gamma di prodotti continua a crescere per cercare di essere accessibile a più laboratori. Altri laboratori ora considerano anche la separazione magnetica. Separatori magnetici vi costerà nel range di $1000 a $10000.
Notizie correlate
- Test immunologici multiplex
- Isolamento del DNA genomico
- Scelta del protocollo di estrazione del DNA appropriato