velmi často plazmidové mapy, zejména historické, které jsou ručně kresleny dávno zapomenutým doktorandem, jsou hádankou. Jaké jsou tyto šipky a krabice? Kde mám začít? Nebojte se, máme rychlokurz úvod do dešifrování plazmidových map.
seznámení se se svým plazmidem, který vás zajímá
začněme klasickým plazmidem: pBR3221. Často se používá jako páteř pro derivační vektory, protože má všechny funkce potřebné pro úspěšné klonování (Obrázek 1). Jak vidíte ze středu mapy, velikost linearizovaného plazmidu je 4361 párů bází. Než začnete pracovat s jakýmkoli plazmidem, je vhodné jej linearizovat řezáním jedinečným restrikčním enzymem, abyste zkontrolovali, zda je inzerovaná velikost zhruba stejná, jak se očekávalo.
Obrázek 1. Schéma pbr322. Obrázek od Avacop & Yikrazuul přes Wikimedia Commons
černé šipky ukazují směr transkripce, který je nezbytný pro klonování. Pokud klonujete svůj Gen zájmu uprostřed jiného genu, ujistěte se, že oba jsou přepsány stejným směrem. Jinak může nativní promotor interferovat s vaší genovou expresí.
Co Znamená „Ori“?
v databázích genových sekvencí jsou takové Entrez-PubMed plazmidové sekvence diagramovány jako lineární sekvence začínající od ori. „Ori“ znamená původ replikace plazmidu. Cokoliv uděláš, neměň to! Jakmile se plazmid nedokáže replikovat, je k ničemu.
další věc, kterou je třeba pamatovat na ori, je, že plazmidy se stejným původem jsou často nekompatibilní. To znamená, že nebudete schopni udržovat dva vektory odvozené od pBR323 v jedné buňce, i když na nich mají geny pro různé rezistence vůči antibiotikům. Pbr322 ori se také používá v pUC18, což je druhá nejběžnější páteř používaná v eukaryotických vektorech.
Kde najdu místa omezení?
restrikční místa pro odpovídající enzymy jsou znázorněna jako svislé čáry s polohou výchozích nukleotidů. Stránky by měly být jedinečné, ale vyplatí se zkontrolovat, protože derivační vektory často obsahují další zapomenuté sekvence.
A Co Geny Rezistence Na Antibiotika?
pBR322 má dva geny rezistence na antibiotika: tet (rezistence na tetracyklin) a amp(rezistence na ampicilin). Tyto geny kódují efluxní pumpu (tetR) a beta-laktamázu (ampR), aby vylučovaly tetracyklin a ampicilin z buňky. Tet a amp jsou čteny v různých směrech.
mějte na paměti, že enzym beta-laktamáza není specifický pro detoxikační antibiotika odvozená od penicilinu. Takže i když máte dva plazmidy s různým původem replikace, nebudete moci vybrat dva plazmidy současně, pokud jeden exprimuje Gen rezistence na methicilin a druhý exprimuje Gen rezistence na ampicilin.
při použití restrikčních enzymových míst ke klonování vašeho genu, který vás zajímá, do vašeho plazmidu, buďte opatrní, abyste se podívali, která místa spadají do vašeho genu rezistence na antibiotika. Například, PvuI řezy uprostřed AmpR, a BamHI řezy uprostřed TetR. A jak všichni víme, narušení genu povede k inaktivaci genové funkce-v tomto případě rezistence na antibiotika.
jak se replikace spouští a zastavuje?
kromě genů plazmidy často zahrnují transkripční promotory a terminátory odvozené z fágů E. coli. Promotory z fágů SP6 a T7 se často používají pro amplifikaci RNA in vitro. Vyžadují fágové polymerázy, a proto jsou in vivo neaktivní.
níže je mapa pTLNX, expresního vektoru Xenopus oocyte (Obrázek 2). Kromě známého původu pBR322 a genů rezistence na antibiotika AmpR a CmR (rezistence na chloramfenikol) jsou přítomny také promotory SP6 a lacUV. Po proudu od promotoru SP6 umožňuje Terminátor rrnBT2 účinné ukončení genů klonovaných do vícenásobného klonovacího místa2 (Obrázek 2).
ptlnx vektor má také gen pro selekci plasmidů (ccdB), spolu s virovým SV40 jaderným lokalizačním signálem a Xenopus globine 3′ UTR, který umožňuje vysoké úrovně exprese klonovaných genů.
znáte své zdroje
domácí mapy jsou často nespolehlivé, protože vynechávají“ nedůležité “ funkce, které mohou být pro váš experiment kritické. Pokud potřebujete vektorovou mapu, je lepší použít známé úložiště map, jako jsou Addgene, Entrez-PubMed a weby společností, které prodávají váš vektor zájmu.
Obrázek 2. Schéma pTLNX. Obrázek z Addgene.
plazmidové mapy se neustále vyvíjejí, takže je pravděpodobné, že vaše příspěvky zůstanou pro vaše budoucí kolegy. Prosím, uveďte co nejvíce podrobností, jak je to možné v mapě! Šťastný mapa čtení a kreslení.
Zdroje:
- Balbás P, Soberón X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). „Plazmidový vektor pBR322 a jeho speciální deriváty-přehled“. Gen. 50 (1-3): 3–40. doi: 1016/0378-1119 (86)90307-0.
- Geertsma ER, Dutzler R. (2011). Univerzální a efektivní vysoce výkonný klonovací nástroj pro strukturální biologii. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z
pomohlo vám to? Pak prosím sdílejte s vaší sítí.