základní výzkum často zahrnuje studium izolovaných buněčných populací. Právě tyto obohacené populace umožňují vědcům objevovat nové objevy o buněčné funkci, signalizaci, genové expresi, rozhodnutích o osudu a mnohem více. Techniky pro rychlé a přesné obohacení populací cílových buněk jsou oblastí velkého zájmu. Techniky třídění buněk spadají do dvou obecných kategorií: hromadné třídění a třídění jednotlivých buněk. Při hromadném třídění buněk jsou všechny cílové buňky shromažďovány v jednom zatáčku, zatímco při třídění jednotlivých buněk je každá buňka individuálně analyzována. Existuje několik metod třídění hromadných buněk: filtrace, centrifugace a třídění magnetických buněk. Hlavní metodou třídění jednotlivých buněk je průtoková cytometrie nebo fluorescenční aktivované třídění buněk. Zatímco třídění buněk může být velmi přesné, je těžké říci, že tříděná populace buněk je „čistá“. Místo toho je shromážděná populace označována jako „obohacená“. Obecně platí, že třídění jednotlivých buněk vede k vysoce obohaceným buněčným populacím, které jsou homogennější než populace získané metodami hromadného třídění.
centrifugace a filtrace
tyto techniky třídění hromadných buněk se spoléhají na vlastnosti buněk, jako je velikost a hustota. Filtrace vyžaduje membránu s konzistentní velikostí pórů menší než cílová buňka, ale větší než nežádoucí úlomky. Membrány s různými velikostmi pórů jsou k dispozici na výběr. Centrifugace se běžně používá k počáteční separaci krve do plazmy, bílých krvinek a červených krvinek. Centrifugace s gradientem hustoty zlepšuje proces separace přidáním materiálu s hustotou mezi frakcí bílých krvinek a frakcí červených krvinek; to umožňuje čisté oddělení mezi nimi. Těžší nebo hustší buňky spadají během odstředění na dno, zatímco méně hustá plazma zůstává nahoře. Tyto techniky jsou užitečné pro hrubé oddělení buněk; pro obohacení specifických typů buněk založených na markerech buněčného povrchu jsou zapotřebí specializovanější techniky.
techniky třídění magnetických buněk
třídění magnetických buněk je technika hromadného obohacování, která může být vysoce specifická. Magnetické třídění pomocí superparamagnetických nanočástic zavádí vysoký stupeň specificity protokolu obohacování buněk. Superparamagnetické nanočástice jsou vyrobeny z jádra oxidu železa, typicky magnetitu (Fe3O4), který není vrozeně magnetický, ale je magnetizován aplikovaným magnetickým polem. Tyto částice nebo kuličky jsou potaženy oxidem křemičitým nebo polymerním povrchem, aby se zabránilo shlukování, a dobře zvolený povlak také poskytuje bohatý povrch pro kovalentní připojení funkčních skupin a protilátek. Připojení protilátek poskytuje superparamagnetickým částicím specificitu. Funkcionalizované částice jsou inkubovány s roztokem cílové buňky a buňky s povrchovými antigeny komplementárními k protilátkám se budou vázat za vzniku konjugátu buňka-korálek. Konjugáty jsou obohaceny separací magnetických buněk. Třídění magnetických buněk je dobrou volbou, pokud je požadována specifičnost. Jiné metody hromadného třídění, jako je filtrace, sedimentace a centrifugace, nemohou dosáhnout takové specifičnosti. Magnetické třídění je rychlé a efektivní. Pokročilé biomagnetické separační systémy mohou zvýšit přesnost třídění poskytováním standardních křivek a optickým monitorováním procesu třídění. Kromě toho jsou pokročilé separační systémy navrženy tak, aby poskytovaly jemné a konzistentní magnetické síly v celém pracovním objemu, aby se zvýšila životaschopnost buněk.
průtoková cytometrie fluorescenční třídění buněk
třídění buněk průtokovou cytometrií analyzuje každou buňku jednotlivě. Jedná se o extrémně výkonnou techniku, která může poskytnout velké množství informací najednou. Průtoková cytometrie je ideální kvantifikační metodou pro multiplexní imunoanalýzy. Buňky jsou před tříděním inkubovány s protilátkami značenými fluoroforem. Protilátky jsou specifické pro povrchové antigeny na cílových buňkách. Každá protilátka má jinou emisní vlnovou délku a je jedinečně identifikovatelná. Jedním ze způsobů přesného značení protilátek fluorofory je značení na perličkách proteinem a.
po inkubaci se značenými protilátkami je buněčný roztok odeslán průtokovým cytometrem. Tento stroj vede roztok tryskou o velikosti mikronů po jedné buňce. Každá buňka se pohybuje laserovou excitační oblastí, kde laser excituje flurofory vázané na povrch buňky. Fluorescenční emise je zaznamenána a buňka je směrována buď do sběrné nádoby, nebo do kontejneru pro odhazování podle uživatelem definovaných parametrů. V jednom běhu lze obohatit více typů buněk a současně se zaznamenávají kvantitativní informace o počtu buněk a procentech celkové populace.
průtoková cytometrie je vysoce informativní metoda a je nejpřesnější technikou třídění buněk, ale je také velmi nákladná. Samotný stroj je často neúměrně drahý a vyžaduje vyškoleného operátora. Mnoho institucí má výzkumné jádro průtokové cytometrie, které účtuje hodinu za používání svých strojů, a tyto sazby mohou být také poměrně vysoké. Z tohoto důvodu se mnoho laboratoří obrací zpět k technikám magnetického třídění. Magnetická separace je specifická, rychlá a efektivní, když je věnována pozornost vývoji a jemnému vyladění třídicí strategie.
náklady na třídič buněk
třídiče buněk mohou stát od těsně pod 100 000 USD do více než 250 000 USD. Nejlevnější buňka kratší bude optimalizována pro jeden typ buněčného markeru a bude obsahovat pouze jeden laser. Cytonom „Viva“ se specializuje na buňky označené GFP a prodává se za méně než 90 000 USD. V rozmezí od 100 000 do 160 000 USD bude mít stroj dva lasery a detekuje více barev. Bio-rad vyrábí stroj, který detekuje 4 barvy a Scindo XT detekuje až 8 barev. Stroje blíže k $ 250,000 budou mít více laserů a dalších funkcí, jako je zvýšení vzorových formátů, které podporuje. Je to stále drahá technologie, i když řada produktů stále roste, aby se pokusila být přístupná více laboratořím. Více laboratoří nyní také zvažuje magnetickou separaci. Magnetické separátory vás budou stát v rozmezí od 1000 do 10000 USD.
související zprávy
- multiplexní imunoanalýzy
- genomická izolace DNA
- výběr vhodného protokolu extrakce DNA