meget ofte plasmidkort, især historiske, der er håndtegnet af en længe glemt ph.d.-studerende, er et puslespil. Hvad er disse pile og kasser? Hvor skal jeg starte? Bare rolig, vi har en introduktion til crashkursus i dechiffrering af plasmidkort.
gør dig bekendt med dit Plasmid af interesse
lad os starte med et klassisk plasmid: pBR3221. Det bruges ofte som rygrad for afledte vektorer, fordi det har alle funktioner, der er nødvendige for en vellykket kloning (Figur 1). Som du ser fra kortcentret, er størrelsen af det lineariserede plasmid 4361 basepar. Før du begynder at arbejde med et plasmid, er det tilrådeligt at linearisere det ved at skære med en unik begrænsning for at kontrollere, at den annoncerede størrelse er omtrent den samme som forventet.
Figur 1. Skematisk af pBR322. Billede af Avacop & Yikrasuul via Commons
de sorte pile viser retningen af transkription, som er afgørende for kloning. Hvis du kloner dit gen af interesse i en midten af et andet gen, skal du sørge for, at de begge transkriberes i samme retning. Ellers kan den indfødte promotor forstyrre din genekspression.
Hvad Betyder “Ori”?
i gensekvensdatabaser er sådanne Plasmidsekvenser diagrammet som lineære sekvenser startende fra ori. “Ori” betyder oprindelsen af plasmidreplikation. Uanset hvad du gør, skal du ikke ændre det! Når et plasmid ikke er i stand til at replikere, er det ubrugeligt.
den anden ting at huske om ori er, at plasmider med samme oprindelse ofte er uforenelige. Dette betyder, at du ikke vil være i stand til at opretholde to pBR323 – afledte vektorer i en celle, selvom de har gener til forskellige antibiotikaresistenser på dem. PBR322 ori bruges også i pUC18, som er den næst mest almindelige rygrad, der anvendes i eukaryote vektorer.
Hvor kan jeg finde Begrænsningsstederne?
restriktionssteder for tilsvarende enheder er vist som lodrette linjer med positionen af startnukleotiderne. Stederne skal være unikke, men det lønner sig at kontrollere, da afledte vektorer ofte indeholder yderligere glemte sekvenser.
Hvad Med Antibiotikaresistensgener?
pBR322 har to antibiotikaresistensgener: tet (tetracyclinresistens) og amp (ampicillinresistens). Disse gener koder for en efflukspumpe (tetR) og beta-lactamase (ampR) for at udskille henholdsvis tetracyclin og ampicillin fra cellen. Tet og amp læses i forskellige retninger.
Husk, at beta-lactamase ikke er specifik til afgiftning af penicillinafledte antibiotika. Så selvom du har to plasmider med forskellig replikationsoprindelse, vil du ikke være i stand til at vælge to plasmider på samme tid, hvis den ene udtrykker et methicillinresistensgen, og den anden udtrykker et ampicillinresistensgen.
når du bruger restriktionssteder til at klone dit gen af interesse i dit plasmid, skal du være forsigtig med at se på, hvilke steder der falder inden for dit antibiotikaresistensgen. For eksempel skærer PvuI midt i AmpR, og BamHI skærer midt i TetR. Og som vi alle ved, vil forstyrrelsen i et gen føre til inaktivering af genfunktion – i dette tilfælde antibiotikaresistens.
Hvordan starter og stopper replikation?
foruden gener inkluderer plasmider ofte transkriptionspromotorer og terminatorer afledt af E. coli-fager. Promotorer fra fager SP6 og T7 bruges ofte til in vitro RNA-amplifikation. De kræver fagpolymeraser og er derfor inaktive in vivo.
nedenfor er et kort over oocytekspressionsvektor (figur 2). Ud over de velkendte pbr322-oprindelses-og antibiotikaresistensgener AmpR og CmR (chloramphenicolresistens) er der også SP6-og lacUV-promotorer til stede. Nedstrøms fra SP6-promotor tillader rrnbt2-terminatoren effektiv afslutning af gener, der klones i det multiple kloningssted2 (figur 2).
vektoren har også et gen til plasmid selektion (ccdB) sammen med virus SV40 nukleart lokaliseringssignal og Ksenopus globine 3′ UTR, der giver mulighed for høje ekspressionsniveauer af klonede gener.
Kend dine kilder
hjemmelavede kort er ofte upålidelige, da de udelader “uvigtige” funktioner, der kan være kritiske for dit eksperiment. Hvis du har brug for et vektorkort, er det bedre at bruge kendte kortlagre som Addgene, entres-PubMed og steder for virksomheder, der sælger din vektor af interesse.
figur 2. Skematisk af ptln. Billede fra Addgene.
Plasmidkort udvikler sig altid, så det er sandsynligt, at dine bidrag vil blive overladt til dine fremtidige kolleger. Medtag så mange detaljer som muligt på dit kort! Glad kort læsning og tegning.
Kilder:
- BALB Kristian P, Sober Kristian P, Merino E, Urica M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). “Plasmidvektor pBR322 og dets derivater til specielle formål-en gennemgang”. Gen. 50 (1-3): 3–40. doi: 1016/0378-1119 (86)90307-0.
- Geertsma ER, hollænder R. (2011). Et alsidigt og effektivt kloningsværktøj med høj kapacitet til strukturel biologi. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178
har dette hjulpet dig? Så del venligst med dit netværk.