grundlæggende forskning involverer ofte undersøgelse af isolerede cellepopulationer. Det er disse berigede populationer, der gør det muligt for forskere at lave nye opdagelser om cellefunktion, signalering, genekspression, skæbnebeslutninger og meget mere. Teknikker til hurtig og nøjagtig berigelse af målcellepopulationer er et område af stor interesse. Cellesorteringsteknikker falder i to generelle kategorier: massesortering og enkeltcellesortering. I massecellesortering samles alle målcellerne i et feje, mens i enkeltcellesortering analyseres hver celle individuelt. Der er flere metoder til bulkcellesortering: filtrering, centrifugering og magnetisk cellesortering. Den vigtigste sorteringsmetode for en enkelt celle er strømningscytometri eller fluorescensaktiveret cellesortering. Mens cellesortering kan være meget nøjagtig, er det svært at sige, at en sorteret cellepopulation er “ren”. I stedet kaldes den indsamlede befolkning “beriget”. Generelt resulterer sortering af enkeltceller i stærkt berigede cellepopulationer, der er mere homogene end dem, der opnås via massesorteringsmetoder.
centrifugering og filtrering
disse massecellesorteringsteknikker er afhængige af celleegenskaber som størrelse og densitet. Filtrering kræver en membran med en ensartet porestørrelse mindre end målcellen, men større end det uønskede affald. Membraner med en række porestørrelser er tilgængelige at vælge imellem. Centrifugering bruges ofte til indledende adskillelse af blod i plasma, hvide blodlegemer og røde blodlegemer. Densitetsgradientcentrifugering forbedrer separationsprocessen ved at tilføje et materiale med en densitet mellem den hvide blodlegemefraktion og den røde blodlegemefraktion; dette muliggør en ren adskillelse mellem de to. De tungere eller mere tætte celler falder til bunden under centrifugering, mens det mindre tætte plasma Forbliver øverst. Disse teknikker er nyttige til grov adskillelse af celler; mere specialiserede teknikker er nødvendige for at berige specifikke celletyper baseret på celleoverflademarkører.
magnetiske Cellesorteringsteknikker
magnetisk cellesortering er en bulkberigelsesteknik, der kan være meget specifik. Magnetisk sortering ved hjælp af superparamagnetiske nanopartikler introducerer en høj grad af specificitet til en celleberigelsesprotokol. Superparamagnetiske nanopartikler er lavet af en kerne af jernilte, typisk magnetit (Fe3O4), som ikke er medfødt magnetisk, men bliver magnetiseret af et påført magnetfelt. Disse partikler eller perler er belagt med silica eller en polymeroverflade for at forhindre klumpning, og en velvalgt belægning giver også en rig overflade til kovalent fastgørelse af funktionelle grupper og antistoffer. Vedhæftningen af antistoffer giver de superparamagnetiske partikler specificitet. De funktionaliserede partikler inkuberes med målcelleopløsningen, og cellerne med overfladeantigener, der er komplementære til antistofferne, binder sig til dannelse af et celle-perlekonjugat. Konjugaterne beriges ved magnetisk celleseparation. Magnetisk cellesortering er et godt valg, når specificitet ønskes. Andre massesorteringsmetoder såsom filtrering, sedimentering og centrifugering kan ikke opnå en sådan specificitet. Magnetisk sortering er hurtig og effektiv. Avancerede biomagnetiske separationssystemer kan øge sorteringsnøjagtigheden ved at levere standardkurver og optisk overvågning af sorteringsprocessen. Derudover er avancerede separationssystemer konstrueret til at give blide og konsistente magnetiske kræfter i hele arbejdsvolumen for at øge cellens levedygtighed.
Strømningscytometri fluorescensbaseret cellesortering
Cellesortering efter strømningscytometri analyserer hver celle individuelt. Dette er en ekstremt kraftfuld teknik, der kan give en stor mængde information på en gang. Strømningscytometri er en ideel kvantificeringsmetode til multipleksimmunoassays. Cellerne inkuberes med fluoroformærkede antistoffer inden sorteringen. Antistofferne er specifikke for overfladeantigener på målceller. Hvert antistof har en anden emissionsbølgelængde og er entydigt identificerbar. En metode til præcis mærkning af antistoffer med fluorophorer er on-perle mærkning med protein A.
efter inkubation med de mærkede antistoffer sendes celleopløsningen gennem strømningscytometeret. Denne maskine leder opløsningen gennem en mikronstørrelse dyse en celle ad gangen. Hver celle bevæger sig gennem et laserekspitteringsområde, hvor laseren ophidser fluroforerne bundet til celleoverfladen. Den fluorescerende emission registreres, og cellen ledes enten i en opsamlingsbeholder eller en kasseringsbeholder i henhold til brugerdefinerede parametre. Flere celletyper kan beriges i et enkelt løb, og kvantitativ information om celletal og procent af den samlede befolkning registreres samtidigt.
Strømningscytometri er en meget informativ metode og er den mest præcise cellesorteringsteknik, men den er også meget dyr. Selve maskinen er ofte uoverkommeligt dyr og kræver en uddannet operatør. Mange institutioner har en strømningscytometriforskningskernefacilitet, der opkræves i timen for brug af deres maskiner, og disse satser kan også være ret høje. Af denne grund vender mange laboratorier tilbage mod magnetiske sorteringsteknikker. Magnetisk adskillelse er specifik, hurtig og effektiv, når man sørger for at udvikle og finjustere en sorteringsstrategi.
cellesorteromkostninger
Cellesorterere kan koste fra lige under $100.000 til over $250.000. Den billigste celle kortere optimeres til en type cellemarkør og indeholder kun en laser. Cytonomet” Viva ” er specialiseret til GFP-mærkede celler og sælger for mindre end $90.000. I intervallet mellem $100.000 og $160.000 vil maskinen have to lasere og vil registrere flere farver. Bio – Rad fremstiller en maskine, der registrerer 4 farver, og Scindo registrerer op til 8 farver. Maskiner tættere på $250.000 vil have flere lasere og andre funktioner såsom stigning i prøveformater, den understøtter. Det er stadig en dyr teknologi at bruge, selvom produktsortimentet fortsætter med at vokse for at forsøge at være tilgængeligt for flere laboratorier. Flere laboratorier overvejer nu også magnetisk adskillelse. Magnetiske separatorer vil koste dig i intervallet $1000 til $10000.
relaterede nyheder
- Multipleksimmunoassays
- genomisk DNA-isolering
- valg af passende DNA-ekstraktionsprotokol