Grundlagenforschung beinhaltet oft die Untersuchung isolierter Zellpopulationen. Es sind diese angereicherten Populationen, die es Forschern ermöglichen, neue Entdeckungen über Zellfunktion, Signalübertragung, Genexpression, Schicksalsentscheidungen und vieles mehr zu machen. Techniken zur schnellen und genauen Anreicherung von Zielzellpopulationen sind ein Bereich von großem Interesse. Zellsortiertechniken lassen sich in zwei allgemeine Kategorien einteilen: Massensortierung und Einzelzellensortierung. Bei der Massenzellsortierung werden alle Zielzellen in einem Sweep gesammelt, während bei der Einzelzellsortierung jede Zelle einzeln analysiert wird. Es gibt mehrere Methoden der Massenzellsortierung: Filtration, Zentrifugation und magnetische Zellsortierung. Die wichtigste Einzelzellsortiermethode ist die Durchflusszytometrie oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Während die Zellsortierung sehr genau sein kann, ist es schwer zu sagen, dass eine sortierte Zellpopulation „rein“ ist. Stattdessen wird die gesammelte Population als „angereichert“ bezeichnet. Im Allgemeinen führt die Einzelzellsortierung zu hoch angereicherten Zellpopulationen, die homogener sind als diejenigen, die durch Massensortierverfahren erhalten werden.
Zentrifugation und Filtration
Diese Massenzellsortiertechniken beruhen auf Zelleigenschaften wie Größe und Dichte. Die Filtration erfordert eine Membran mit einer konsistenten Porengröße, die kleiner als die Zielzelle, aber größer als die unerwünschten Ablagerungen ist. Membranen mit einer Vielzahl von Porengrößen stehen zur Auswahl. Die Zentrifugation wird üblicherweise zur anfänglichen Trennung von Blut in Plasma, weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen verwendet. Die Dichtegradientenzentrifugation verbessert den Trennprozess durch Zugabe eines Materials mit einer Dichte zwischen der Fraktion der weißen Blutkörperchen und der Fraktion der roten Blutkörperchen; Dies ermöglicht eine saubere Trennung zwischen den beiden. Die schwereren oder dichteren Zellen fallen während der Zentrifugation auf den Boden, während das weniger dichte Plasma oben bleibt. Diese Techniken sind nützlich für die grobe Trennung von Zellen; speziellere Techniken sind erforderlich, um bestimmte Zelltypen basierend auf Zelloberflächenmarkern anzureichern.
Magnetische Zellsortiertechniken
Die magnetische Zellsortierung ist eine Massenanreicherungstechnik, die sehr spezifisch sein kann. Die magnetische Sortierung mit superparamagnetischen Nanopartikeln führt zu einem hohen Maß an Spezifität für ein Zellanreicherungsprotokoll. Superparamagnetische Nanopartikel bestehen aus einem Kern aus Eisenoxid, typischerweise Magnetit (Fe3O4), der nicht von Natur aus magnetisch ist, sondern durch ein angelegtes Magnetfeld magnetisiert wird. Diese Partikel oder Kügelchen sind mit Kieselsäure oder einer Polymeroberfläche beschichtet, um ein Verklumpen zu verhindern, und eine gut gewählte Beschichtung bietet auch eine reichhaltige Oberfläche für die kovalente Bindung von funktionellen Gruppen und Antikörpern. Die Anlagerung von Antikörpern verleiht den superparamagnetischen Partikeln Spezifität. Die funktionalisierten Partikel werden mit der Zielzelllösung inkubiert, und die Zellen mit Oberflächenantigenen, die zu den Antikörpern komplementär sind, binden, um ein Zell-Bead-Konjugat zu bilden. Die Konjugate werden durch magnetische Zellseparation angereichert. Magnetische Zellsortierung ist eine gute Wahl, wenn Spezifität gewünscht wird. Andere Massensortierverfahren wie Filtration, Sedimentation und Zentrifugation können eine solche Spezifität nicht erreichen. Magnetische Sortierung ist schnell und effizient. Fortschrittliche biomagnetische Trennsysteme können die Sortiergenauigkeit erhöhen, indem sie Standardkurven und eine optische Überwachung des Sortierprozesses bereitstellen. Darüber hinaus wurden fortschrittliche Trennsysteme entwickelt, um sanfte und konsistente magnetische Kräfte über das gesamte Arbeitsvolumen bereitzustellen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen.
Durchflusszytometrie fluoreszenzbasierte Zellsortierung
Die Zellsortierung durch Durchflusszytometrie analysiert jede Zelle einzeln. Dies ist eine äußerst leistungsstarke Technik, die eine große Menge an Informationen gleichzeitig bereitstellen kann. Die Durchflusszytometrie ist eine ideale Quantifizierungsmethode für Multiplex-Immunoassays. Die Zellen werden vor der Sortierung mit fluorophormarkierten Antikörpern inkubiert. Die Antikörper sind spezifisch für Oberflächenantigene auf Zielzellen. Jeder Antikörper hat eine andere Emissionswellenlänge und ist eindeutig identifizierbar. Eine Methode zur genauen Markierung von Antikörpern mit Fluorophoren ist die On-Bead-Markierung mit Protein A.
Nach Inkubation mit den markierten Antikörpern wird die Zelllösung durch das Durchflusszytometer geschickt. Diese Maschine führt die Lösung zellweise durch eine mikrongroße Düse. Jede Zelle bewegt sich durch einen Laseranregungsbereich, in dem der Laser die an die Zelloberfläche gebundenen Flurophores anregt. Die Fluoreszenzemission wird aufgezeichnet, und die Zelle wird nach benutzerdefinierten Parametern entweder in einen Sammelbehälter oder in einen Entsorgungsbehälter geleitet. Mehrere Zelltypen können in einem einzigen Lauf angereichert werden, und quantitative Informationen über Zellzahlen und Prozent der Gesamtpopulation werden gleichzeitig aufgezeichnet.
Die Durchflusszytometrie ist eine sehr informative Methode und die präziseste Zellsortiertechnik, aber auch sehr teuer. Die Maschine selbst ist oft unerschwinglich teuer und erfordert einen geschulten Bediener. Viele Institutionen verfügen über eine Durchflusszytometrie-Forschungskerneinrichtung, die stundenweise Gebühren für die Nutzung ihrer Maschinen erhebt, und diese Raten können auch recht hoch sein. Aus diesem Grund wenden sich viele Labore wieder der magnetischen Sortiertechnik zu. Die magnetische Trennung ist spezifisch, schnell und effizient, wenn darauf geachtet wird, eine Sortierstrategie zu entwickeln und fein abzustimmen.
Zellsortierer kosten
Zellsortierer können von knapp unter $ 100.000 bis über $ 250.000 kosten. Die billigsten Zelltypen werden für einen Zellmarkertyp optimiert und enthalten nur einen Laser. Das Zytonom „Viva“ ist auf GFP-markierte Zellen spezialisiert und kostet weniger als 90.000 US-Dollar. Im Bereich zwischen 100.000 und 160.000 US-Dollar verfügt die Maschine über zwei Laser und erkennt mehr Farben. Bio-rad stellt eine Maschine her, die 4 Farben erkennt, und der Scindo XT erkennt bis zu 8 Farben. Maschinen, die näher an den 250.000 US-Dollar liegen, verfügen über mehr Laser und andere Funktionen, z. B. die Erhöhung der unterstützten Probenformate. Es ist immer noch eine teure Technologie zu verwenden, obwohl die Produktpalette weiter wächst, um zu versuchen, für mehr Labors zugänglich zu sein. Mehr Laboratorien betrachten jetzt auch magnetische Trennung. Magnetabscheider kosten Sie im Bereich von 1000 bis 10000 US-Dollar.
Verwandte Nachrichten
- Multiplex-Immunoassays
- Genomische DNA-Isolierung
- Auswahl des geeigneten DNA-Extraktionsprotokolls