fundamenteel onderzoek omvat vaak de studie van geïsoleerde celpopulaties. Het zijn deze verrijkte populaties die onderzoekers in staat stellen om nieuwe ontdekkingen te doen over celfunctie, signaleren, genexpressie, noodbeslissingen en nog veel meer. De technieken voor de snelle en nauwkeurige verrijking van de populaties van de doelcel zijn een gebied van groot belang. Celsorteertechnieken vallen in twee algemene categorieën: bulksortering en eencellige sortering. In bulkcel Sorteren worden alle doelcellen verzameld in één sweep, terwijl in één cel Sorteren elke cel individueel wordt geanalyseerd. Er zijn meerdere methoden voor het sorteren van bulkcellen: filtratie, centrifugering en het sorteren van magnetische cellen. De belangrijkste eencellige sorterende methode is cytometry stroom of fluorescentie geactiveerde cel Sorteren. Hoewel het sorteren van cellen zeer nauwkeurig kan zijn, is het moeilijk om te zeggen dat een gesorteerde celpopulatie “zuiver”is. In plaats daarvan wordt de verzamelde bevolking aangeduid als “verrijkt”. Over het algemeen resulteert het eencellige sorteren in sterk verrijkte celpopulaties die homogener zijn dan die verkregen via bulksorteermethoden.
centrifugeren en filtreren
deze sorteertechnieken voor bulkcellen zijn gebaseerd op celkenmerken zoals grootte en dichtheid. De filtratie vereist een membraan met een consistente poriegrootte kleiner dan de doelcel, maar groter dan het ongewenste puin. Membranen met verschillende poriematen zijn beschikbaar om uit te kiezen. De centrifugering wordt algemeen gebruikt voor aanvankelijke scheiding van bloed in plasma, witte bloedcellen, en rode bloedcellen. De centrifugering van de dichtheidsgradiënt verbetert het scheidingsproces door een materiaal met een dichtheid tussen de witte bloedcelfractie en de rode bloedcelfractie toe te voegen; dit maakt een schone scheiding tussen de twee mogelijk. De zwaardere, of meer dichte cellen vallen naar de bodem tijdens het centrifugeren, terwijl de minder dichte plasma blijft aan de top. Deze technieken zijn nuttig voor ruwe scheiding van cellen; meer gespecialiseerde technieken zijn nodig voor het verrijken van specifieke celtypes die op de tellers van de celoppervlakte worden gebaseerd.
sorteertechnieken voor magnetische cellen
Sorteertechnieken voor magnetische cellen zijn een techniek voor bulkverrijking die zeer specifiek kan zijn. Het magnetische Sorteren gebruikend superparamagnetic nanoparticles introduceert een hoge graad van specificiteit aan een protocol van de celverrijking. Superparamagnetische nanodeeltjes worden gemaakt van een kern van ijzeroxide, typisch magnetiet (Fe3O4), die niet van nature magnetisch is, maar wordt gemagnetiseerd door een toegepast magnetisch veld. Deze deeltjes of parels worden met een laag bedekt met kiezelzuur of een polymeeroppervlakte om klonteren te verhinderen, en een goed gekozen deklaag verstrekt ook een rijke oppervlakte voor de covalente gehechtheid van functionele groepen en antilichamen. De hechting van antilichamen geeft de superparamagnetische deeltjes specificiteit. De gefunctionaliseerde deeltjes worden geïncubeerd met de oplossing van de doelcel, en de cellen met oppervlakteantigenen complementair aan de antilichamen zullen binden om een cel-parel conjugaat te vormen. De conjugaten worden verrijkt door magnetische celscheiding. Magnetische cel sortering is een goede keuze wanneer specificiteit gewenst is. Andere bulksorteermethoden zoals filtratie, sedimentatie en centrifugering kunnen dergelijke specificiteit niet bereiken. Magnetisch sorteren is snel en efficiënt. Geavanceerde biomagnetische scheidingssystemen kunnen de sorteernauwkeurigheid verhogen door standaardcurves en optische monitoring van het sorteerproces te bieden. Bovendien zijn geavanceerde scheidingssystemen ontworpen om zachte en consistente magnetische krachten door het werkvolume te leveren om de levensvatbaarheid van de cel te verhogen.
flowcytometrie op fluorescentie gebaseerde celsortering
celsortering door flowcytometrie analyseert elke cel afzonderlijk. Dit is een uiterst krachtige techniek die een grote hoeveelheid informatie in een keer kan verstrekken. Cytometry de stroom is een ideale kwantificeringsmethode voor multiplex immunoassays. De cellen worden uitgebroed met fluorophore-geëtiketteerde antilichamen vóór de soort. De antilichamen zijn specifiek voor oppervlakteantigenen op doelcellen. Elk antilichaam heeft een verschillende emissiegolflengte en is uniek identificeerbaar. Één methode om antilichamen met fluorophores precies te etiketteren is op-Parel etiketteren met proteã ne A.
na incubatie met de geëtiketteerde antilichamen, wordt de celoplossing door de stroomcytometer verzonden. Deze machine leidt de oplossing door een micron-formaat mondstuk een cel per keer. Elke cel beweegt zich door een gebied van de laseropwekking, waar de laser de flurophores opwekt die aan de celoppervlakte worden gebonden. De fluorescente emissie wordt geregistreerd, en de cel wordt geleid hetzij in een inzamelingscontainer of een teruggooicontainer volgens door de gebruiker gedefinieerde parameters. De veelvoudige celtypes kunnen in één enkele looppas worden verrijkt, en de kwantitatieve informatie over celaantallen en het percentage van totale bevolking wordt gelijktijdig geregistreerd.Flow cytometrie is een zeer informatieve methode, en is de meest nauwkeurige celsorteertechniek, maar het is ook erg duur. De machine zelf is vaak onbetaalbaar duur en vereist een getrainde operator. Vele instellingen hebben een cytometry de kernfaciliteit van het stroomonderzoek die door het uur voor gebruik van hun machines laadt, en deze tarieven kunnen ook vrij hoog zijn. Daarom keren veel laboratoria terug naar magnetische sorteertechnieken. Magnetische scheiding is specifiek, snel en efficiënt wanneer er zorg wordt besteed aan het ontwikkelen en fijn afstemmen van een sorteerstrategie.
Celsorteerder kost
Celsorteerders kunnen kosten van iets minder dan $ 100.000 tot meer dan $250.000. De goedkoopste cel korter zal worden geoptimaliseerd voor één type celmarker en bevat slechts één laser. Cytonome “Viva” is gespecialiseerd voor GFP geëtiketteerde cellen en verkoopt voor minder dan $90,000. In het bereik tussen $100.000 en $160.000 zal de machine twee lasers hebben en zal meer kleuren detecteren. Bio-rad maakt een machine die 4 kleuren detecteert, en de Scindo XT detecteert tot 8 kleuren. Machines dichter bij de $ 250,000 zal meer lasers en andere functies, zoals toename van de steekproef formaten ondersteunt. Het is nog steeds een dure technologie om te gebruiken, hoewel het aanbod van producten blijft groeien om te proberen toegankelijk te zijn voor meer laboratoria. Meer laboratoria overwegen nu ook magnetische scheiding. Magnetische afscheiders kost u in het bereik van $1000 tot $10000.
Related news
- Multiplex immunoassays
- Genomic DNA isolation
- Choosing the appropiate DNA extraction protocol