heel vaak zijn plasmid maps, vooral historische kaarten die met de hand zijn getekend door een lang vergeten promovendus, een puzzel. Wat zijn deze pijlen en dozen? Waar moet ik beginnen? Maak je geen zorgen, we hebben een spoedcursus introductie in het ontcijferen van plasmide kaarten.
vertrouwd raken met uw interessante plasmide
laten we beginnen met een klassieke plasmide: pBR3221. Het wordt vaak gebruikt als backbone voor afgeleide vectoren omdat het alle functies heeft die nodig zijn voor een succesvol klonen (figuur 1). Zoals je ziet in het KaartCentrum, is de grootte van het gelineariseerde plasmide 4361 basisparen. Voordat u begint met het werken met een plasmide, is het raadzaam om het te lineariseren door te snijden met een unieke restrictie enzym om te controleren of de geadverteerde grootte ongeveer hetzelfde is als verwacht.
figuur 1. Schema van pBR322. Afbeelding door Avacop & Yikrazuul via Wikimedia Commons
de zwarte pijlen tonen de richting van de transcriptie, die essentieel is voor het klonen. Als u uw gen van belang klonen in een midden van een ander gen, zorg ervoor dat beide worden getranscribeerd in dezelfde richting. Anders kan de native promotor zich bemoeien met je genexpressie.
Wat Betekent “Ori”?
in databases met gensequenties, zoals Entrez-PubMed, worden plasmidesequenties als lineaire sequenties vanaf de ori weergegeven. “Ori”: de oorsprong van plasmide-replicatie. Wat je ook doet, verander het niet! Zodra een plasmide niet meer kan repliceren, is het nutteloos.
het andere ding om te onthouden over ori is dat plasmiden met dezelfde oorsprong vaak onverenigbaar zijn. Dit betekent dat u niet in staat zult zijn om twee pbr323 – afgeleide vectoren in één cel te behouden, zelfs als ze genen voor verschillende antibioticaresistentie op hen hebben. Pbr322 ori wordt ook gebruikt in pUC18, die de tweede gemeenschappelijkste die backbone in eukaryotic vectoren wordt gebruikt is.
Waar Kan ik de Beperkingssites vinden?
restrictieplaatsen voor overeenkomstige enzymen worden weergegeven als verticale lijnen met de positie van de beginnende nucleotiden. De sites moeten uniek zijn, maar het loont om te controleren, omdat afgeleide vectoren vaak extra vergeten sequenties bevatten.
Hoe Zit Het Met Genen Voor Antibioticaresistentie?
pBR322 heeft twee antibioticaresistentiegenen: tet (tetracyclineresistentie) en amp (ampicillineresistentie). Deze genen coderen een effluxpomp (tetR) en bèta-lactamase (ampR) om tetracycline en ampicilline uit de cel te scheiden, respectievelijk. Tet en amp worden in verschillende richtingen gelezen.
houd er rekening mee dat enzym bèta-lactamase niet specifiek is voor het ontgiften van antibiotica die zijn afgeleid van penicilline. Dus zelfs als je twee plasmiden met verschillende oorsprong van replicatie hebt, zul je niet in staat zijn om twee plasmiden tegelijkertijd te selecteren als de ene een meticilline resistentiegen uitdrukt en de andere een ampicilline resistentiegen.
wanneer u restrictie-enzymplaatsen gebruikt om uw gen van belang in uw plasmide te klonen, let dan op welke plaatsen binnen uw antibioticaresistentiegen vallen. Bijvoorbeeld, PvuI snijdt in het midden van AmpR, en BamHI snijdt in het midden van TetR. En, zoals we allemaal weten, zal de verstoring in een gen leiden tot inactivering van de genfunctie – in dit geval antibioticaresistentie.
hoe Start en stopt replicatie?
naast genen omvatten plasmiden vaak transcriptiepromotors en terminatoren afgeleid van E. colifagen. De promotors van fagen SP6 en T7 worden vaak gebruikt voor de versterking van in vitro RNA. Zij vereisen phage polymerases en zijn daarom inactief in vivo.
Hieronder is een kaart van Ptlnx , een Xenopus oöcyte-expressievector (Figuur 2). Naast de bekende pbr322 oorsprong en antibiotische resistentie genen AmpR en CmR( chlooramfenicol resistentie), zijn er ook SP6 en lacUV promotors aanwezig. Stroomafwaarts van SP6 promotor, staat de terminator rrnBT2 efficiënte beëindiging van genen toe die in de veelvoudige het klonen site2 worden gekloond (Figuur 2).
de ptlnx Vector heeft ook een gen voor plasmide selectie (ccdb), samen met virus SV40 nuclear localization signal en Xenopus globine 3′ UTR, dat hoge expressieniveaus van gekloonde genen mogelijk maakt.
Ken uw bronnen
zelfgemaakte kaarten zijn vaak onbetrouwbaar omdat ze” onbelangrijke ” functies weglaten die van cruciaal belang kunnen zijn voor uw experiment. Als u een vector kaart nodig hebt, is het beter om bekende kaart repositories zoals Addgene, Entrez-PubMed, en sites van bedrijven die uw vector van belang te verkopen gebruiken.
Figuur 2. Schema van pTLNX. Afbeelding van Addgene.
Plasmidekaarten zijn altijd in ontwikkeling, dus het is waarschijnlijk dat uw bijdragen zullen worden overgelaten aan uw toekomstige collega ‘ s. Gelieve zo veel mogelijk details in uw kaart! Gelukkig kaart lezen en tekenen.
Bronnen:
- Balbás P, Soberón X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N ,Bolivar F (1986). “Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives-a review”. Gen. 50 (1-3): 3–40. doi: 1016/0378-1119 (86)90307-0.
- Geertsma ER, Dutzler R. (2011). Een veelzijdig en efficiënt high-throughput het klonen hulpmiddel voor structurele biologie. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z
heeft dit je geholpen? Dan kunt u delen met uw netwerk.