grundforskning involverar ofta studier av isolerade cellpopulationer. Det är dessa berikade populationer som gör det möjligt för forskare att göra nya upptäckter om cellfunktion, signalering, genuttryck, ödebeslut och mycket mer. Tekniker för snabb och exakt anrikning av målcellpopulationer är ett område av stort intresse. Cellsorteringstekniker faller i två allmänna kategorier: bulksortering och sortering av enstaka celler. Vid sortering av bulkceller samlas alla målceller i ett svep, medan vid sortering av enskilda celler analyseras varje cell individuellt. Det finns flera metoder för bulkcellsortering: filtrering, centrifugering och magnetisk cellsortering. Den huvudsakliga singelcellsorteringsmetoden är flödescytometri eller fluorescensaktiverad cellsortering. Medan cellsortering kan vara mycket exakt är det svårt att säga att en sorterad cellpopulation är ”ren”. Istället kallas den samlade befolkningen som ”berikad”. I allmänhet resulterar enkelcellsortering i högberikade cellpopulationer som är mer homogena än de som erhålls via bulksorteringsmetoder.
centrifugering och filtrering
dessa sorteringstekniker för bulkceller är beroende av Cellegenskaper som storlek och densitet. Filtrering kräver ett membran med en konsekvent porstorlek mindre än målcellen, men större än det oönskade skräpet. Membran med olika porstorlekar finns att välja mellan. Centrifugering används ofta för initial separation av blod i plasma, vita blodkroppar och röda blodkroppar. Densitetsgradientcentrifugering förbättrar separationsprocessen genom att tillsätta ett material med en densitet mellan den vita blodkroppsfraktionen och den röda blodkroppsfraktionen; detta möjliggör en ren separation mellan de två. De tyngre eller tätare cellerna faller till botten under centrifugering, medan den mindre täta plasman förblir överst. Dessa tekniker är användbara för grov separation av celler; mer specialiserade tekniker behövs för att berika specifika celltyper baserat på cellytmarkörer.
magnetiska cellsorteringstekniker
magnetisk cellsortering är en bulkanrikningsteknik som kan vara mycket specifik. Magnetisk sortering med hjälp av superparamagnetiska nanopartiklar introducerar en hög grad av specificitet till ett cellanrikningsprotokoll. Superparamagnetiska nanopartiklar är gjorda av en kärna av järnoxid, typiskt magnetit (Fe3O4), som inte är medfödd magnetisk, men blir magnetiserad av ett applicerat magnetfält. Dessa partiklar eller pärlor är belagda med kiseldioxid eller en polymeryta för att förhindra klumpning, och en väl vald beläggning ger också en rik yta för kovalent bindning av funktionella grupper och antikroppar. Bindningen av antikroppar ger de superparamagnetiska partiklarna specificitet. De funktionaliserade partiklarna inkuberas med målcellslösningen, och cellerna med ytantigener komplementära till antikropparna kommer att binda för att bilda ett cellpärlkonjugat. Konjugaterna berikas genom magnetisk cellseparation. Magnetisk cellsortering är ett bra val när specificitet önskas. Andra bulksorteringsmetoder som filtrering, sedimentering och centrifugering kan inte uppnå sådan specificitet. Magnetisk sortering är snabb och effektiv. Avancerade biomagnetiska separationssystem kan öka sorteringsnoggrannheten genom att tillhandahålla standardkurvor och optisk övervakning av sorteringsprocessen. Dessutom är avancerade separationssystem konstruerade för att ge mjuka och konsekventa magnetiska krafter i hela arbetsvolymen för att öka cellens livskraft.
flödescytometri fluorescensbaserad cellsortering
cellsortering genom flödescytometri analyserar varje cell individuellt. Detta är en extremt kraftfull teknik som kan ge en stor mängd information på en gång. Flödescytometri är en idealisk kvantifieringsmetod för multipleximmunanalyser. Cellerna inkuberas med fluorofor-märkta antikroppar före sorten. Antikropparna är specifika för ytantigener på målceller. Varje antikropp har en annan emissionsvåglängd och är unikt identifierbar. En metod för exakt märkning av antikroppar med fluoroforer är märkning på pärla med protein A.
efter inkubation med de märkta antikropparna skickas celllösningen genom flödescytometern. Denna maskin styr lösningen genom en mikron-storlek munstycke en cell i taget. Varje cell rör sig genom ett laser exciteringsområde, där lasern exciterar fluroforerna bundna till cellytan. Den fluorescerande emissionen registreras och cellen riktas antingen in i en uppsamlingsbehållare eller en kasseringsbehållare enligt användardefinierade parametrar. Flera celltyper kan berikas i en enda körning, och kvantitativ information om cellnummer och procent av den totala befolkningen registreras samtidigt.
flödescytometri är en mycket informativ metod och är den mest exakta cellsorteringstekniken, men den är också mycket dyr. Maskinen i sig är ofta oöverkomligt dyr och kräver en utbildad operatör. Många institutioner har en flödescytometriforskning kärnanläggning som laddar per timme för användning av sina maskiner, och dessa priser kan också vara ganska höga. Av denna anledning vänder många laboratorier tillbaka mot magnetiska sorteringstekniker. Magnetisk separation är specifik, snabb och effektiv när försiktighet vidtas för att utveckla och finjustera en sorteringsstrategi.
cellsorterare kostar
cellsorterare kan kosta från strax under $100,000 till över $250,000. Den billigaste cellen kortare kommer att optimeras för en typ av cellmarkör och innehåller endast en laser. Cytonomen” Viva ” är specialiserad för GFP-märkta celler och säljer för mindre än $90,000. I intervallet mellan $100,000 och $160,000 kommer maskinen att ha två lasrar och kommer att upptäcka fler färger. Bio-rad gör en maskin som upptäcker 4 färger, och Scindo XT upptäcker upp till 8 färger. Maskiner närmare $ 250,000 kommer att ha fler Lasrar och andra funktioner som ökning av provformat som den stöder. Det är fortfarande en dyr teknik att använda, även om sortimentet av produkter fortsätter att växa för att försöka vara tillgängligt för fler laboratorier. Fler laboratorier överväger nu också magnetisk separation. Magnetiska separatorer kostar dig i intervallet $1000 till $10000.
relaterade nyheter
- multiplex immunoassays
- genomisk DNA-isolering
- välja lämpligt DNA-extraktionsprotokoll