Nybörjarguiden för att läsa Plasmidkartor

mycket ofta är plasmidkartor, särskilt Historiska som är handritade av en långglömd doktorand, ett pussel. Vad är dessa pilar och lådor? Var börjar jag? Oroa dig inte, vi har en snabbkurs introduktion till dechiffrera plasmid kartor.

bekanta dig med din Plasmid av intresse

låt oss börja med en klassisk plasmid: pBR3221. Det används ofta som ryggrad för derivatvektorer eftersom det har alla funktioner som behövs för en framgångsrik kloning (Figur 1). Som du ser från kartcentret är storleken på den linjäriserade plasmid 4361 baspar. Innan du börjar arbeta med någon plasmid, är det lämpligt att linjärisera det genom att skära med ett unikt restriktionsenzym för att kontrollera att den annonserade storleken är ungefär densamma som förväntat.

Figur 1. Schematisk av pBR322. Bild av Avacop & Yikrazuul via Wikimedia Commons

de svarta pilarna visar riktningen för transkription, vilket är viktigt för kloning. Om du klonar din gen av intresse i mitten av en annan gen, se till att båda transkriberas i samma riktning. Annars kan den infödda promotorn störa ditt genuttryck.

Vad Betyder” Ori”?

i gensekvensdatabaser är sådana entrez-PubMed, plasmidsekvenser schematiska som linjära sekvenser som börjar från ori. ”Ori” betyder ursprunget till plasmidreplikation. Vad du än gör, Ändra inte det! När en plasmid inte kan replikera är den värdelös.

den andra saken att komma ihåg om ori är att plasmider med samma ursprung ofta är oförenliga. Detta innebär att du inte kommer att kunna behålla två pbr323 – härledda vektorer i en cell även om de har gener för olika antibiotikaresistens på dem. PBR322 ori används också i pUC18, som är den näst vanligaste ryggraden som används i eukaryota vektorer.

Var hittar jag Begränsningsplatserna?

restriktionsställen för motsvarande enzymer visas som vertikala linjer med positionen för startnukleotiderna. Webbplatserna bör vara unika, men det lönar sig att kontrollera, eftersom derivatvektorer ofta innehåller ytterligare glömda sekvenser.

Vad Sägs Om Antibiotikaresistensgener?

pBR322 har två antibiotikaresistensgener: tet (tetracyklinresistens) och amp (ampicillinresistens). Dessa gener kodar för en effluxpump (tetR) och beta-laktamas (ampR) för att utsöndra tetracyklin respektive ampicillin från cellen. Tet och amp läses i olika riktningar.

Tänk på att enzymet beta-laktamas inte är specifikt vid avgiftning av penicillinderiverade antibiotika. Så även om du har två plasmider med olika ursprung för replikering, kommer du inte att kunna välja två plasmider samtidigt om man uttrycker en meticillinresistensgen och den andra uttrycker en ampicillinresistensgen.

när du använder restriktionsenzymställen för att klona din gen av intresse i din plasmid, var noga med att titta på vilka platser som faller inom din antibiotikaresistensgen. Till exempel, PvuI skär i mitten av AmpR, och BamHI skär i mitten av TetR. Och som vi alla vet kommer störningen i en gen att leda till inaktivering av genfunktionen – i detta fall antibiotikaresistens.

Hur startar och stoppar replikering?

förutom gener inkluderar plasmider ofta transkriptionspromotorer och terminatorer härledda från E. coli-fager. Promotorer från fager SP6 och T7 används ofta för in vitro RNA-amplifiering. De kräver fagpolymeraser och är därför inaktiva in vivo.

nedan är en karta över pTLNX , en Xenopus oocytuttrycksvektor (Figur 2). Förutom det välkända pbr322-ursprunget och antibiotikaresistensgenerna AmpR och CmR (kloramfenikolresistens) finns det också SP6-och lacUV-promotorer närvarande. Nedströms från SP6-promotorn möjliggör rrnbt2-terminatorn effektiv avslutning av gener klonade i multipelkloningsplatsen2 (Figur 2).

ptlnx-vektorn har också en gen för plasmidval (ccdB), tillsammans med virus SV40 nukleär lokaliseringssignal och Xenopus globin 3′ UTR, som möjliggör höga uttrycksnivåer av klonade gener.

Känn dina källor

hemlagade kartor är ofta opålitliga eftersom de utelämnar ”obetydliga” funktioner som kan vara kritiska för ditt experiment. Om du behöver en vektorkarta är det bättre att använda kända kartförvar som Addgene, Entrez-PubMed och webbplatser för företag som säljer din Vektor av intresse.

Figur 2. Schematisk av pTLNX. Bild från Addgene.

Plasmidkartor utvecklas alltid, så det är troligt att dina bidrag kommer att lämnas till dina framtida kollegor. Vänligen inkludera så många detaljer som möjligt i din karta! Lycklig kartläsning och ritning.

Källor:

1. BALB Usbi S P, Sober Usbi N X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). ”Plasmidvektor pBR322 och dess specialderivat-en recension”. Gen. 50 (1-3): 3–40. doi: 1016/0378-1119 (86)90307-0.
2. Geertsma ER, Dutzler R. (2011). Ett mångsidigt och effektivt kloningsverktyg med hög genomströmning för strukturbiologi. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z