hyvin usein plasmidikarttoja, erityisesti historiallisia karttoja, jotka kauan sitten unohdettu Tohtorikoulutettava on käsin piirtänyt, on arvoitus. Mitä nämä nuolet ja laatikot ovat? Mistä aloitan? Meillä on pikakurssi plasmidikarttojen tulkitsemiseen.
tutustuminen kiinnostavaan Plasmidiisi
aloitetaan klassisella plasmidilla: pBR3221. Sitä käytetään usein derivaattavektorien runkona, koska siinä on kaikki onnistuneeseen kloonaukseen tarvittavat ominaisuudet (Kuva 1). Kuten karttakeskuksesta näkee, linearisoidun plasmidin koko on 4361 emäsparia. Ennen kuin aloitat työskentelyn minkään plasmidin kanssa, on suositeltavaa linearisoida se leikkaamalla ainutlaatuisella restriktioentsyymillä tarkistaaksesi, että mainostettu koko on suurin piirtein sama kuin odotettiin.
Kuva 1. Pbr322: n kaava. Avacopin julkaisema kuva & Yikrazuul Wikimedia Commonsissa
mustat nuolet näyttävät transkription suunnan, joka on välttämätön kloonaukselle. Jos kloonaat kiinnostavan geenisi toisen geenin keskeltä, varmista, että molemmat ovat litteroituja samaan suuntaan. Muuten natiivi promoottori voi häiritä geeniekspressiota.
Mitä ” Ori ” Tarkoittaa?
geenisekvenssitietokannoissa, kuten Entrez-Pubmedissa, plasmidisekvenssit on diagrammattu lineaarisiksi sekvensseiksi alkaen Orista. ”Ori” tarkoittaa plasmidireplikaation alkuperää. Mitä ikinä teetkin, älä muuta sitä! Kun plasmidi ei kykene monistumaan, se on hyödytön.
toinen oreista muistettava asia on, että samaa alkuperää olevat plasmidit ovat usein yhteensopimattomia. Tämä tarkoittaa, että et pysty säilyttämään kahta pBR323 – johdettua vektoria yhdessä solussa, vaikka niillä olisi geenit eri antibioottiresistensseille. PBR322 Oria käytetään myös puc18: ssa, joka on toiseksi yleisin eukaryoottisilla vektoreilla käytetty selkäranka.
Mistä löydän Rajoituspaikat?
vastaavien entsyymien Restriktiokohdat on esitetty pystyviivoina aloitusnukleotidien sijainnin kanssa. Sivustojen pitäisi olla uniikkeja, mutta tarkistaminen kannattaa, sillä derivaattavektoreissa on usein ylimääräisiä unohdettuja sekvenssejä.
Entä Antibioottiresistenssigeenit?
pBR322: lla on kaksi antibioottiresistenssigeeniä: tet (tetrasykliiniresistenssi) ja amp (ampisilliiniresistenssi). Nämä geenit koodaavat effluksipumpun (tetR) ja beetalaktamaasin (ampR) erittämään tetrasykliiniä ja ampisilliinia solusta. Tet ja amp luetaan eri suuntiin.
on muistettava, että beetalaktamaasientsyymi ei ole spesifinen penisilliinijohdannaisten antibioottien detoksifioinnissa. Joten vaikka sinulla on kaksi plasmidia, joilla on eri alkuperää replikaation, et voi valita kahta plasmidia samanaikaisesti, jos toinen ilmaisee metisilliiniresistenssigeenin ja toinen ampisilliiniresistenssigeenin.
kun käytät restriktioentsyymikohtia kloonataksesi plasmidiisi kiinnostavan geenin, tarkkaile huolellisesti, mitkä alueet kuuluvat antibioottiresistenssigeeniisi. Esimerkiksi PvuI leikkaa AmpR: n keskellä ja BamHI leikkaa TetR: n keskellä. Ja kuten me kaikki tiedämme, geenin häiriöt johtavat geenitoiminnan inaktivoitumiseen-tässä tapauksessa antibioottiresistenssiin.
miten replikaatio alkaa ja loppuu?
plasmideihin kuuluu geenien lisäksi usein E. coli-fageista johdettuja transkription promoottoreita ja terminaattoreita. Fagien SP6 ja T7 promoottoreita käytetään usein in vitro RNA-monistukseen. Ne vaativat faagipolymeraaseja ja ovat siksi in vivo inaktiivisia.
alla on kartta pTLNX: stä, joka on Xenopus-munasolun ilmentymävektori (kuva 2). Tuttujen pbr322-alkuperä-ja antibioottiresistenssigeenien AmpR ja CmR (kloramfenikoliresistenssi) lisäksi mukana on myös SP6-ja lacUV-promoottoreita. SP6-promoottorin jälkeen rrnbt2-terminaattori mahdollistaa kloonattujen geenien tehokkaan terminoinnin moninkertaiseen kloonaukseen site2 (kuva 2).
pTLNX-vektorilla on myös geeni plasmidien valintaan (ccdB) yhdessä viruksen SV40-ydinlokalisaatiosignaalin ja Xenopus globine 3′ UTR: n kanssa, joka mahdollistaa kloonattujen geenien suuret ilmentymistasot.
tiedä lähteesi
kotitekoiset kartat ovat usein epäluotettavia, koska niistä puuttuu ”merkityksettömiä” ominaisuuksia, jotka voivat olla kriittisiä kokeesi kannalta. Jos tarvitset vektorikarttaa, on parempi käyttää tunnettuja karttatietovarastoja, kuten Addgene, Entrez-PubMed ja sivustoja yrityksistä, jotka myyvät vektori kiinnostaa.
kuva 2. Ptlnx: n kaava. Kuva levyltä Addgene.
Plasmidikartat kehittyvät koko ajan, joten on todennäköistä, että osuutesi jäävät tuleville kollegoillesi. Sisällytä karttaasi niin monta yksityiskohtaa kuin mahdollista! Hyvää karttojen lukemista ja piirtämistä.
Lähteet:
- Balbás P, Soberón X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F (1986). Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives–a review. Geeni. 50 (1-3): 3–40. doi: 1016/0378-1119 (86)90307-0.
- Geertsma ER, Dutzler R. (2011). Monipuolinen ja tehokas suuritehoinen kloonaustyökalu rakennebiologiaan. 50(15):3272-8. doi: 10.1021 / bi200178z
onko tämä auttanut sinua? Jaa sitten verkkosi kanssa.