perustutkimukseen kuuluu usein eristettyjen solupopulaatioiden tutkiminen. Juuri nämä rikastetut populaatiot antavat tutkijoille mahdollisuuden tehdä uusia löytöjä solujen toiminnasta, signaloinnista, geenien ilmentymisestä, kohtalonpäätöksistä ja paljon muuta. Kohdesolupopulaatioiden nopeaan ja tarkkaan rikastamiseen tähtäävät tekniikat ovat erittäin kiinnostava ala. Kennojen lajittelutekniikat jaetaan kahteen yleiseen kategoriaan: irtolajitteluun ja yhden solun lajitteluun. Irtosolulajittelussa kaikki kohdesolut kerätään yhteen pyyhkäisyyn, kun taas yksittäisessä solulajittelussa jokainen solu analysoidaan erikseen. Irtosolulajitteluun on useita menetelmiä: suodatus, sentrifugointi ja magneettisolulajittelu. Tärkein yksisolulajittelumenetelmä on virtaussytometria tai fluoresenssilla aktivoitu solulajittelu. Vaikka solujen lajittelu voi olla hyvin tarkkaa, on vaikea sanoa, että lajiteltu solupopulaatio olisi ”puhdas”. Sen sijaan kerätystä väestöstä käytetään nimitystä ”rikastettu”. Yleensä yksisolulajittelu johtaa pitkälle rikastuneisiin solupopulaatioihin, jotka ovat homogeenisempia kuin irtolajittelumenetelmillä saadut.
sentrifugointi ja suodatus
nämä irtosolulajittelutekniikat perustuvat solun ominaisuuksiin, kuten kokoon ja tiheyteen. Suodatus vaatii kalvon, jonka huokosten koko on kohdesolua pienempi, mutta suurempi kuin ei-toivotut roskat. Valittavana on kalvoja, joissa on erilaisia huokoskokoja. Sentrifugointia käytetään yleisesti veren erottamiseen plasmaksi, valkosoluiksi ja punasoluiksi. Tiheysgradientin sentrifugointi parantaa erotusprosessia lisäämällä materiaalia, jonka tiheys on valkosolufraktion ja punasolufraktion välillä; tämä mahdollistaa näiden kahden puhtaan erottelun. Raskaammat eli tiheämmät solut putoavat sentrifugoinnin aikana pohjalle, kun taas harvempi plasma jää pinnalle. Nämä tekniikat ovat hyödyllisiä karkea erottaminen solujen; erikoistuneempia tekniikoita tarvitaan tiettyjen solutyyppien rikastamiseen solun pintamarkkereiden perusteella.
Magneettisolulajittelutekniikka
Magneettisolulajittelu on irtorikastustekniikka, joka voi olla hyvin spesifinen. Magneettinen lajittelu superparamagneettisia nanohiukkasia käyttäen tuo solunrikastusprotokollalle suuren spesifisyyden. Superparamagneettiset nanohiukkaset koostuvat rautaoksidista, tyypillisesti magnetiitista (Fe3O4), joka ei ole luonnostaan magneettinen, vaan magnetoituu sovellettavan magneettikentän vaikutuksesta. Nämä hiukkaset tai helmet on päällystetty piidioksidilla tai polymeeripinnalla paakkuuntumisen estämiseksi, ja hyvin valittu pinnoite tarjoaa myös rikkaan pinnan funktionaalisten ryhmien ja vasta-aineiden kovalenttiselle kiinnittymiselle. Vasta-aineiden kiinnittyminen antaa superparamagneettisille hiukkasille spesifisyyden. Funktionalisoituneet hiukkaset inkuboidaan kohdesoluliuoksella, ja vasta-aineita täydentäviä pinta-antigeenejä sisältävät solut sitoutuvat muodostaen soluhelmikonjugaatin. Konjugaatit rikastetaan magneettisoluerotuksella. Magneettisolulajittelu on hyvä valinta silloin, kun spesifisyyttä halutaan. Muilla irtolajittelumenetelmillä, kuten suodattamisella, sedimentoinnilla ja sentrifugoinnilla, ei voida saavuttaa tällaista spesifisyyttä. Magneettinen lajittelu on nopeaa ja tehokasta. Kehittyneet biomagneettiset erotusjärjestelmät voivat lisätä lajittelutarkkuutta tarjoamalla standardikäyriä ja lajitteluprosessin optista seurantaa. Lisäksi kehittyneet erotusjärjestelmät on suunniteltu tarjoamaan hellävaraisia ja johdonmukaisia magneettisia voimia koko työskentelytilavuuden parantamiseksi.
Virtaussytometria fluoresenssiin perustuva solulajittelu
solun lajittelu virtaussytometrialla analysoimalla jokainen solu erikseen. Tämä on erittäin tehokas tekniikka, joka voi tarjota suuren määrän tietoa kerralla. Virtaussytometria on ihanteellinen kvantifiointimenetelmä multiplex-immunomäärityksille. Solut inkuboidaan fluoriforeilla merkityillä vasta-aineilla ennen lajiketta. Vasta-aineet ovat spesifisiä kohdesolujen pinta-antigeeneille. Jokaisella vasta-aineella on erilainen emissioaallonpituus ja se on yksilöllisesti tunnistettavissa. Eräs menetelmä vasta-aineiden täsmälliseen merkitsemiseen fluoriforeilla on valkuaisainemerkintä A: lla.
merkityillä vasta-aineilla inkuboinnin jälkeen soluliuos lähetetään virtaussytometrin läpi. Tämä kone ohjaa liuoksen mikronikokoisen suuttimen läpi solu kerrallaan. Jokainen solu liikkuu laser-eksitaatioalueen läpi,jossa laser kiihottaa solun pintaan sitoutuneita fluroforeja. Fluoresoiva emissio kirjataan, ja kenno ohjataan joko keräysastiaan tai hävitysastiaan käyttäjän määrittelemien parametrien mukaisesti. Useita solutyyppejä voidaan rikastuttaa yhdellä ajolla, ja kvantitatiivista tietoa solujen määrästä ja prosenteista kokonaispopulaatiosta tallennetaan samanaikaisesti.
Virtaussytometria on erittäin informatiivinen menetelmä ja tarkin solulajittelutekniikka, mutta se on myös hyvin kallis. Kone itsessään on usein kohtuuttoman kallis ja vaatii koulutetun käyttäjän. Monilla laitoksilla on virtaussytometriatutkimuksen ydinlaitos, joka veloittaa tunneittain koneiden käytöstä, ja nämä hinnat voivat myös olla melko korkeita. Tästä syystä monet laboratoriot ovat kääntymässä takaisin magneettisten lajittelutekniikoiden puoleen. Magneettinen erottaminen on erityistä, nopeaa ja tehokasta, kun huolehditaan lajittelustrategian kehittämisestä ja hienosäätämisestä.
solujen lajittelukustannukset
solujen lajittelijat voivat maksaa hieman alle 100 000 dollarista yli 250 000 dollariin. Halvin kenno lyhyempi on optimoitu yhden tyyppinen solumarkkeri ja sisältää vain yhden laserin. Cytonome ”Viva”on erikoistunut GFP merkitty soluja ja myy alle $90,000. 100 000-160 000 dollarin välillä koneessa on kaksi laseria ja se havaitsee enemmän värejä. Bio-rad tekee koneen, joka tunnistaa 4 väriä, ja Scindo XT tunnistaa jopa 8 väriä. Koneet lähempänä $250,000 on enemmän lasereita ja muita ominaisuuksia, kuten kasvu näyte formaatteja se tukee. Se on edelleen kallis tekniikka käyttää, vaikka tuotevalikoima kasvaa edelleen yrittää olla saatavilla enemmän laboratorioita. Useammat laboratoriot harkitsevat nyt myös magneettista erottelua. Magneettiset erottimet maksavat 1000-10000 dollaria.
Related news
- Multiplex immunomääritykset
- genomien DNA isolation
- Choosing the appropiate DNA extraction protocol